體外構建組織工程“結膜囊移植體”治療重度結膜囊狹窄的實驗研究.pdf

1、目的:
　　 探討不同創(chuàng)傷方式引起兔結膜囊狹窄的特點，建立穩(wěn)定的結膜囊狹窄動物模型。應用組織工程技術體外構建“結膜囊移植體”，并探討其治療重度結膜囊狹窄的效果。
　　 方法:
　　 1.結膜囊狹窄動物模型的建立
　　 30只兔隨機分為4組:熱燒傷組9只，分別用400℃電焊頭逐點燒傷結膜囊3s、6s和10s;堿燒傷組9只，分別用2M NaOH燒傷結膜囊30s、60s和120s;酸燒傷組9只，分別用正庚酸原液

2、燒傷結膜囊60s、120s和180s;眼表上皮切除組3只，切除全部球結膜、穹窿結膜和淺層角膜，以及大部分瞼結膜。術后觀察結膜囊的變化，4周后測量結膜囊深度，判斷結膜囊狹窄程度，組織病理學檢查察結膜創(chuàng)面的修復情況。
　　 2.應用口腔黏膜上皮細胞體外構建組織工程“結膜囊移植體”
　　 選擇聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、透明質酸鈉交聯共聚物(CLSH)和羊膜(AM)做為黏膜上皮細胞體外培養(yǎng)的載體材料。取兔頰部口腔黏膜上

3、皮細胞，體外擴增得到足夠數量的種子細胞。將細胞分別接種到三種載體，檢測細胞在不同載體上的粘附和增殖能力。選擇6只兔，每只兔雙眼鼻上和顳上球結膜下分別做一直徑10mm囊袋，其中三個分別植入三種載體材料，另一個做為空白對照，觀察局部炎癥反應和材料的吸收情況，術后2周和4周分別取材行組織病理學檢查，觀察材料吸收情況以及局部炎癥反應和纖維組織增生情況。選擇一組織相容性好的載體接種口腔黏膜上皮細胞，然后包覆于塑料薄殼義眼片表面，體外培養(yǎng)7～10天

4、，組織病理學和免疫組織化學檢測材料上細胞生長情況。
　　 3.結膜囊移植體治療結膜囊狹窄的初步研究
　　 將6只重度結膜囊狹窄兔隨機分成三組，均接受結膜囊成形手術治療。A組植入口腔黏膜上皮細胞體外構建的結膜囊移植體，B組植入以AM和薄殼義眼片構建的復合載體，C組植入單純薄殼義眼片。術后兩周取出薄殼義眼片，測量結膜囊深度;一月后再次測量結膜囊深度，計算結膜囊的收縮比例，組織病理學和免疫組織化學檢測結膜囊上皮的修復情況以及細

5、胞的表型變化。
　　 結果:
　　 （一）熱燒傷組術后球結膜和穹隆結膜環(huán)形收縮形成雙結膜囊結構，燒傷10s者出現眼瞼缺血壞死，術后4周3例燒傷10s者達重度結膜囊狹窄，但均有明顯眼瞼缺損和瞼緣粘連;組織病理學檢查顯示外結膜囊內結膜上皮排列紊亂，上皮下膠原纖維增生明顯，而內側結膜囊內大部分結膜上皮形態(tài)規(guī)整。酸燒傷組術后24小時結膜缺血完全恢復，術后4周結膜囊狹窄程度均為輕度;組織病理學檢查顯示結膜上皮細胞形態(tài)良好，結膜下僅

6、見少許膠原纖維增生。堿燒傷組術后早期結膜缺血壞死，72h后部分血運逐漸恢復，術后周兩例180s燒傷者出現角膜穿孔，術后4周僅1例出現重度結膜囊狹窄;組織病理學檢查示殘存結膜上皮細胞排列紊亂，結膜下膠原纖維增生明顯。眼表上皮切除組術后結膜囊逐漸縮窄、廣泛瞼球粘連，角膜創(chuàng)面被假性胬肉覆蓋，術后4周所有結膜囊狹窄程度均達重度;組織病理學檢查示結膜創(chuàng)面大量膠原纖維增生。
　　 （二）兔口腔黏膜上皮細胞在六孔板內擴增一代，可得到1～2×1

7、06個/孔。細胞在不同材料上的粘附能力分別為CLSH＞AM＞PLGA，細胞在材料上的增殖能力分別為AM＞PLGA＞CLSH。載體結膜下植入后，空白對照和AM植入部位1周內局部充血完全消退，術后2周結膜下AM結構已分辨不清;PLGA和CLSH植入部位結膜充血逐漸減輕，至術后4周局部結膜血管仍明顯擴張，結膜下形成暗紅色結節(jié)樣腫物，以PLGA較為明顯。組織病理學檢查顯示AM植入部位術后2周僅見少量炎性細胞浸潤，術后4周完全消失;CLSH植入部

8、位大量多核巨細胞浸潤，周圍新生血管和纖維組織增生;PLGA植入部位大量嗜酸性粒細胞浸潤，周圍纖維組織增生明顯，形成囊樣結構。口腔黏膜上皮細胞接種到AM后5天，可見克隆形成，包覆義眼片后細胞克隆繼續(xù)增殖并形成細胞單層，組織病理學和免疫組織化學檢查顯示“結膜囊移植體”表面均有黏膜上皮細胞單層形成，CK3和P63染色陽性。
　　 （三）6只兔均成功接受結膜囊成形手術。術后2周取出義眼片后A組結膜囊深度為10～14mm，B組9.5～13

9、.5mm，C組8.5～14.5mm;術后6周A組兔結膜囊深度為6.5～11mm，B組為5～9mm，C組為3.5～7.5mm。組織病理學檢查顯示三組兔重建的結膜囊均見單層黏膜上皮細胞覆蓋，部分區(qū)域可見接近正常結膜上皮結構;免疫組織化學檢查顯示A組深部結膜囊少量上皮細胞CK3和CK4表達陽性;B和C組CK4表達陽性，未見CK3表達。
　　 結論:
　　 眼表切除法可以建立穩(wěn)定的重度結膜囊狹窄動物模型。以AM為載體可以在體外構