體外構(gòu)建組織工程“結(jié)膜囊移植體”治療重度結(jié)膜囊狹窄的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　 探討不同創(chuàng)傷方式引起兔結(jié)膜囊狹窄的特點(diǎn)，建立穩(wěn)定的結(jié)膜囊狹窄動(dòng)物模型。應(yīng)用組織工程技術(shù)體外構(gòu)建“結(jié)膜囊移植體”，并探討其治療重度結(jié)膜囊狹窄的效果。
　　 方法:
　　 1.結(jié)膜囊狹窄動(dòng)物模型的建立
　　 30只兔隨機(jī)分為4組:熱燒傷組9只，分別用400℃電焊頭逐點(diǎn)燒傷結(jié)膜囊3s、6s和10s;堿燒傷組9只，分別用2M NaOH燒傷結(jié)膜囊30s、60s和120s;酸燒傷組9只，分別用正庚酸原液

2、燒傷結(jié)膜囊60s、120s和180s;眼表上皮切除組3只，切除全部球結(jié)膜、穹窿結(jié)膜和淺層角膜，以及大部分瞼結(jié)膜。術(shù)后觀察結(jié)膜囊的變化，4周后測(cè)量結(jié)膜囊深度，判斷結(jié)膜囊狹窄程度，組織病理學(xué)檢查察結(jié)膜創(chuàng)面的修復(fù)情況。
　　 2.應(yīng)用口腔黏膜上皮細(xì)胞體外構(gòu)建組織工程“結(jié)膜囊移植體”
　　 選擇聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、透明質(zhì)酸鈉交聯(lián)共聚物(CLSH)和羊膜(AM)做為黏膜上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的載體材料。取兔頰部口腔黏膜上

3、皮細(xì)胞，體外擴(kuò)增得到足夠數(shù)量的種子細(xì)胞。將細(xì)胞分別接種到三種載體，檢測(cè)細(xì)胞在不同載體上的粘附和增殖能力。選擇6只兔，每只兔雙眼鼻上和顳上球結(jié)膜下分別做一直徑10mm囊袋，其中三個(gè)分別植入三種載體材料，另一個(gè)做為空白對(duì)照，觀察局部炎癥反應(yīng)和材料的吸收情況，術(shù)后2周和4周分別取材行組織病理學(xué)檢查，觀察材料吸收情況以及局部炎癥反應(yīng)和纖維組織增生情況。選擇一組織相容性好的載體接種口腔黏膜上皮細(xì)胞，然后包覆于塑料薄殼義眼片表面，體外培養(yǎng)7～10天

4、，組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測(cè)材料上細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
　　 3.結(jié)膜囊移植體治療結(jié)膜囊狹窄的初步研究
　　 將6只重度結(jié)膜囊狹窄兔隨機(jī)分成三組，均接受結(jié)膜囊成形手術(shù)治療。A組植入口腔黏膜上皮細(xì)胞體外構(gòu)建的結(jié)膜囊移植體，B組植入以AM和薄殼義眼片構(gòu)建的復(fù)合載體，C組植入單純薄殼義眼片。術(shù)后兩周取出薄殼義眼片，測(cè)量結(jié)膜囊深度;一月后再次測(cè)量結(jié)膜囊深度，計(jì)算結(jié)膜囊的收縮比例，組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)膜囊上皮的修復(fù)情況以及細(xì)

5、胞的表型變化。
　　 結(jié)果:
　　 （一）熱燒傷組術(shù)后球結(jié)膜和穹隆結(jié)膜環(huán)形收縮形成雙結(jié)膜囊結(jié)構(gòu)，燒傷10s者出現(xiàn)眼瞼缺血壞死，術(shù)后4周3例燒傷10s者達(dá)重度結(jié)膜囊狹窄，但均有明顯眼瞼缺損和瞼緣粘連;組織病理學(xué)檢查顯示外結(jié)膜囊內(nèi)結(jié)膜上皮排列紊亂，上皮下膠原纖維增生明顯，而內(nèi)側(cè)結(jié)膜囊內(nèi)大部分結(jié)膜上皮形態(tài)規(guī)整。酸燒傷組術(shù)后24小時(shí)結(jié)膜缺血完全恢復(fù)，術(shù)后4周結(jié)膜囊狹窄程度均為輕度;組織病理學(xué)檢查顯示結(jié)膜上皮細(xì)胞形態(tài)良好，結(jié)膜下僅

6、見(jiàn)少許膠原纖維增生。堿燒傷組術(shù)后早期結(jié)膜缺血壞死，72h后部分血運(yùn)逐漸恢復(fù)，術(shù)后周兩例180s燒傷者出現(xiàn)角膜穿孔，術(shù)后4周僅1例出現(xiàn)重度結(jié)膜囊狹窄;組織病理學(xué)檢查示殘存結(jié)膜上皮細(xì)胞排列紊亂，結(jié)膜下膠原纖維增生明顯。眼表上皮切除組術(shù)后結(jié)膜囊逐漸縮窄、廣泛瞼球粘連，角膜創(chuàng)面被假性胬肉覆蓋，術(shù)后4周所有結(jié)膜囊狹窄程度均達(dá)重度;組織病理學(xué)檢查示結(jié)膜創(chuàng)面大量膠原纖維增生。
　　 （二）兔口腔黏膜上皮細(xì)胞在六孔板內(nèi)擴(kuò)增一代，可得到1～2×1

7、06個(gè)/孔。細(xì)胞在不同材料上的粘附能力分別為CLSH＞AM＞PLGA，細(xì)胞在材料上的增殖能力分別為AM＞PLGA＞CLSH。載體結(jié)膜下植入后，空白對(duì)照和AM植入部位1周內(nèi)局部充血完全消退，術(shù)后2周結(jié)膜下AM結(jié)構(gòu)已分辨不清;PLGA和CLSH植入部位結(jié)膜充血逐漸減輕，至術(shù)后4周局部結(jié)膜血管仍明顯擴(kuò)張，結(jié)膜下形成暗紅色結(jié)節(jié)樣腫物，以PLGA較為明顯。組織病理學(xué)檢查顯示AM植入部位術(shù)后2周僅見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，術(shù)后4周完全消失;CLSH植入部

8、位大量多核巨細(xì)胞浸潤(rùn)，周?chē)律芎屠w維組織增生;PLGA植入部位大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，周?chē)w維組織增生明顯，形成囊樣結(jié)構(gòu)?？谇火つど掀ぜ?xì)胞接種到AM后5天，可見(jiàn)克隆形成，包覆義眼片后細(xì)胞克隆繼續(xù)增殖并形成細(xì)胞單層，組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)檢查顯示“結(jié)膜囊移植體”表面均有黏膜上皮細(xì)胞單層形成，CK3和P63染色陽(yáng)性。
　　 （三）6只兔均成功接受結(jié)膜囊成形手術(shù)。術(shù)后2周取出義眼片后A組結(jié)膜囊深度為10～14mm，B組9.5～13

9、.5mm，C組8.5～14.5mm;術(shù)后6周A組兔結(jié)膜囊深度為6.5～11mm，B組為5～9mm，C組為3.5～7.5mm。組織病理學(xué)檢查顯示三組兔重建的結(jié)膜囊均見(jiàn)單層黏膜上皮細(xì)胞覆蓋，部分區(qū)域可見(jiàn)接近正常結(jié)膜上皮結(jié)構(gòu);免疫組織化學(xué)檢查顯示A組深部結(jié)膜囊少量上皮細(xì)胞CK3和CK4表達(dá)陽(yáng)性;B和C組CK4表達(dá)陽(yáng)性，未見(jiàn)CK3表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 眼表切除法可以建立穩(wěn)定的重度結(jié)膜囊狹窄動(dòng)物模型。以AM為載體可以在體外構(gòu)