微囊化新生大鼠卵巢組織體外及異體移植的實驗研究.pdf

1、卵巢是婦女重要的內(nèi)分泌和生殖器官，由于卵巢早衰、卵巢先天發(fā)育異?；蛉比纭⒉±硇月殉睬谐?、惡性腫瘤放化療等原因失去卵巢功能后，將引起一系列內(nèi)分泌失調(diào)及失去生育功能的問題。傳統(tǒng)的激素替代療法(HomoneReplacementTherapy，HRT)，由于外源性雌激素在體內(nèi)呈非生理性釋放，可產(chǎn)生一些嚴重副反應，增加乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生率，如果患者本身合并有血栓性疾病(如下肢血栓性靜脈炎)或者乳腺癌，SLE等疾病時，激素替代療法更受到極大

2、的限制。 同時，隨著手術(shù)、化療和放療聯(lián)合應用技術(shù)的發(fā)展，年輕惡性腫瘤患者的長期生存率也在逐步提高，而這些治療往往導致性腺的損傷，給患者生存質(zhì)量和生育能力造成嚴重影響。作為女性內(nèi)分泌功能和生殖功能恢復的一種手段，卵巢移植受到各國學者的越來越多的重視。 生殖器官包括卵巢組織的移植，早在100多年以前就在人類和動物模型中應用，但由于移植效果不理想，這一技術(shù)多年來被長期遺棄，但是隨著90年代卵巢冷凍保存技術(shù)，免疫移植學的發(fā)展，人

3、們又一次看到了卵巢移植應用于臨床的巨大潛力。 80年代初，Lim和Sun發(fā)明的海藻酸鈉-聚左賴氨酸-海藻酸鈉(Alignate-Poly(l)lysine-Alignate，APA)微囊膜，是兩層海藻酸鈉夾一層聚左賴氨酸的“三明治”結(jié)構(gòu)膜。將特定的細胞包裹于該微囊膜中，利用微囊膜的半透性，氧、營養(yǎng)物質(zhì)等小分子可透過膜供給細胞，使之保持生理活性，而細胞分泌的生物活性產(chǎn)物也可從微囊中透出，起到特定作用；同時具有免疫活性的大分子物質(zhì)、

4、細胞等不能通過微囊膜攻擊囊內(nèi)細胞，從而起到免疫隔離的作用。在其它內(nèi)分泌低下的疾病，學者們發(fā)現(xiàn)通過微囊化組織移植解決內(nèi)分泌激素替代治療，可以同時避免免疫排斥問題以及替代治療所帶來的非生理性釋放問題。目前這一方法已成為醫(yī)學和生物工程領域的研究熱點，甲狀腺、胰島、甲狀旁腺、垂體、腎上腺嗜鉻細胞等微囊化的研究已經(jīng)開展了很多。 本研究選擇了海藻酸鈉-聚左賴氨酸-海藻酸鈉(Alignate-Poly(l)lysine-Alignate，AP

5、A)微囊作為免疫隔離工具，采用高壓靜電法包裹新生SD大鼠卵巢組織，體外培養(yǎng)微囊，通過光學顯微鏡觀察微囊的體外狀態(tài)，用免疫化學分析法檢測雌二醇(E2)、孕酮(P)分泌情況，投射電鏡觀察卵巢組織結(jié)構(gòu)；并將微囊移植入去勢大鼠腹腔中，檢測大鼠血清中雌、孕激素變化情況，用陰道涂片觀察大鼠動情周期恢復情況，在不同時間回收觀察微囊，從而探討運用APA微囊技術(shù)的卵巢移植的可行性。 體外實驗結(jié)果表明：相同條件下制得的微囊粒徑均勻，表面光滑，通過光

6、學顯微鏡觀察，可見到微囊化后的新生大鼠卵巢組織在囊內(nèi)分化發(fā)育，邊界模糊不清，組織團反光良好，隨著培養(yǎng)時間的延長，部分組織有逐漸沿囊壁生長現(xiàn)象。體外培養(yǎng)條件下組織持續(xù)分泌E2、P，培養(yǎng)液中E2、P濃度，分別在第14天及第21天時E2、P濃度達最高峰，以后隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，E2、P濃度稍下降后持續(xù)維持穩(wěn)定濃度。透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，卵巢組織中顆粒細胞隨著培養(yǎng)時間的延長，發(fā)育成為黃體粒性細胞，在培養(yǎng)4周后的微囊化新生大鼠卵巢組織中可見到大量黃

7、體粒性細胞，胞核大，染色質(zhì)顆粒細，分布均勻，胞質(zhì)內(nèi)細胞器豐富，有高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、脂滴等。說明卵巢組織在囊內(nèi)分化發(fā)育良好。 為進一步評價微囊化新生大鼠卵巢組織進行移植的可行性，我們建立了卵巢功能喪失的去勢SD雌性大鼠模型，在體內(nèi)觀察APA微囊的作用和存活情況。實驗結(jié)果表明：去勢大鼠腹腔移植微囊后無異常，E2、P水平上升，在移植20天后，不同時期血清中E2、P水平與對照組比較均有顯著差異，通過陰道細胞涂片檢查，移植后20.

8、54±4.60天涂片開始出現(xiàn)改變，有角化細胞周期性出現(xiàn)，同時在不同時間回收的微囊大部分形態(tài)完整，常規(guī)錐蟲藍染色存活率均高于70％。說明移植后的APA微囊能持續(xù)穩(wěn)定釋放E2、P，明顯改善大鼠卵巢功能，在大鼠體內(nèi)有良好的生物相容性。 總之，用高壓靜電法制備的APA微囊化新生SD大鼠卵巢組織，能夠在體內(nèi)和體外存活和分化發(fā)育，并持續(xù)釋放E2、P，治療實驗性卵巢功能喪失大鼠，說明APA微囊有良好的免疫隔離作用，運用微囊技術(shù)的卵巢移植有一定