微囊化卵巢顆粒細(xì)胞長期體外培養(yǎng)及同種異體體內(nèi)移植的研究.pdf

1、絕經(jīng)及絕經(jīng)后期是婦女卵巢功能消失及其后的一段很長的時期。絕經(jīng)所帶來的一系列癥狀嚴(yán)重影響了婦女的自信心和生活質(zhì)量，尤其是對那些POF和卵巢切除手術(shù)的年輕婦女。對絕經(jīng)期的更年期綜合征，臨床上通常采用的是激素替代治療或雌激素替代治療，來彌補雌激素缺乏所帶來的一系列癥狀。但HERS和WHI的兩份報告對HRT的受益/風(fēng)險比的重新進行界定使全球范圍內(nèi)的HRT在過去的幾年的應(yīng)用產(chǎn)生了停滯甚至是倒退。因此，探討可行的內(nèi)源性激素替代治療方法對解決無生育要

2、求的絕經(jīng)婦女，特別是對POF的婦女意義重大。
　　 細(xì)胞移植技術(shù)可以用于治療人類某種蛋白或激素缺乏的疾病。細(xì)胞微囊化技術(shù)可以克服細(xì)胞移植治療中的免疫排斥反應(yīng)。以往對細(xì)胞微囊化移植的研究主要集中于胰島、嗜鉻細(xì)胞、肝細(xì)胞、甲狀旁腺細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞等治療內(nèi)分泌/代謝疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，而對同樣具有內(nèi)分泌功能的卵巢顆粒細(xì)胞微囊化治療絕經(jīng)后的雌激素缺乏相關(guān)癥狀的研究目前國內(nèi)外尚無報道。
　　 為探討微囊化卵巢顆粒細(xì)胞移植治療絕經(jīng)綜

3、合征的可行性，本研究主要從以下幾個方面進行了研究：1.卵巢顆粒細(xì)胞的獲取及體外活性和功能的研究；2.微囊化卵巢顆粒細(xì)胞的制備及體外活性和功能的研究；3.微囊化卵巢顆粒細(xì)胞異體移植對同種異體去勢大鼠內(nèi)分泌功能和生殖系統(tǒng)的影響；為臨床上POF及絕經(jīng)婦女微囊化卵巢顆粒細(xì)胞的同種異體移植提供理論基礎(chǔ)。
　　 第一部分：卵巢顆粒細(xì)胞的獲取及體外活性和功能的研究
　　 目的：觀察卵巢顆粒細(xì)胞長期在體外無血清培養(yǎng)體系中形態(tài)和內(nèi)分泌功能

4、的改變，探討卵巢顆粒細(xì)胞在無血清體系中最長生存時間和生物學(xué)活性。
　　 方法：
　　 1.從26日齡未成年雌性SD大鼠獲取原代卵巢顆粒細(xì)胞，采用FSHR對顆粒細(xì)胞進行免疫組化鑒定；
　　 2.WST方法測定顆粒細(xì)胞在不同濃度FSH刺激48小時后的OD值，判斷顆粒細(xì)胞對FSH刺激的增殖反應(yīng)；
　　 3.卵巢顆粒細(xì)胞長期體外培養(yǎng)45天，培養(yǎng)液中加添不同濃度的FSH，顯微鏡下觀察顆粒細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量的變化，EL

5、ISA法檢測顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液上清中E+和P的分泌。
　　 結(jié)果：
　　 1.免疫組化的結(jié)果提示卵巢顆粒細(xì)胞的FSHR位于細(xì)胞漿，獲得的顆粒細(xì)胞的FSHR的陽性率>90％；
　　 2.WST方法檢測到，體外培養(yǎng)的卵巢顆粒細(xì)胞的增殖對不同濃度的FSH呈劑量依賴性；WST作用后顆粒細(xì)胞的OD值隨FSH濃度的增大而增大，F(xiàn)SH100ng/ml組OD值最高，與其他組相比差異有顯著性；
　　 3.原代卵巢顆粒細(xì)胞24-

6、48小時貼壁，貼壁后的成短梭形或多角形。第7-9天，細(xì)胞伸展成長梭形并完全融合；培養(yǎng)的第9天到第20天左右，細(xì)胞連接成片狀，狀態(tài)良好。從體外培養(yǎng)的第21天開始，細(xì)胞開始萎縮，凋亡，逐漸變得如干枯狀，數(shù)量減少；至培養(yǎng)的第30天，細(xì)胞數(shù)量減少明顯，剩余的細(xì)胞簇所占面積大約占六孔板每個孔面積的1/6至1/8左右。培養(yǎng)的第31天至45天，細(xì)胞凋亡的進程加快，到培養(yǎng)的第45天時，顆粒細(xì)胞大部分已解體，細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失。FSH2.5ng/ml和25ng

7、/ml組未見明顯加快顆粒細(xì)胞貼壁和融合，減慢顆粒細(xì)胞凋亡的作用。
　　 4.顆粒細(xì)胞在體外培養(yǎng)的第3,9,15,21,27,33,39和45天E?的分泌水平不同，差異有顯著性，而不同濃度的FSH對顆粒細(xì)胞分泌E?的影響差異也有顯著性。FSH0ng/ml組和FSH2.5ng/ml組培養(yǎng)的卵巢顆粒細(xì)胞在培養(yǎng)的第9天，E?的分泌達(dá)到最高峰（2244.6～2369.9）pg/ml，與培養(yǎng)的第3天相比差異有顯著性；培養(yǎng)的第15天到第39天

8、內(nèi)，E?水平保持較高水平，變化不大；到第45天時，顆粒細(xì)胞E?的分泌水平降至第3天水平。FSH25ng/ml組，在體外培養(yǎng)的第3天E?水平即達(dá)到最高峰2244.6pg/ml，第9天到第39天E?的分泌維持高水平，與第3天比差異無顯著性。第45天E?水平降低至1869 pg/ml，顯著低于第3天。顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)第3天時E?的分泌水平對FSH濃度成劑量依賴性的增加，在FSH25ng/ml組分泌水平最高達(dá)2244.6pg/ml，差異有顯著性

9、。
　　 5.顆粒細(xì)胞在體外培養(yǎng)的第3,9,15,21,27,33,39和45天P的分泌水平不同，差異有顯著性；FSH濃度對顆粒細(xì)胞分泌P的影響差異也有顯著性。在FSH0ng/ml組中，顆粒細(xì)胞在培養(yǎng)的第9天達(dá)到最高峰1.07ng/ml，第15天開始下降，一直維持在（7.6～8.1）ng/ml左右直到體外培養(yǎng)的第45天；而在FSH2.5ng/ml和FSH25ng/ml組在各時間點顆粒細(xì)胞分泌的P水平差異無顯著性。在體外培養(yǎng)的第9

10、天，F(xiàn)SH2.5ng/ml和FSH25ng/ml組P的產(chǎn)生量顯著低于FSH0ng/ml組，差異有顯著性，其余各時間點不同濃度FSH對顆粒細(xì)胞產(chǎn)生P無顯著影響.
　　 第二部分：微囊化卵巢顆粒細(xì)胞的制備及體外活性和功能的研究
　　 目的：制備微囊化的卵巢顆粒細(xì)胞，探討微囊化卵巢顆粒細(xì)體外培養(yǎng)的生物學(xué)特性。
　　 方法：
　　 1.應(yīng)用海藻酸鈉和氯化鋇采用“一步成囊法”制備微囊化卵巢顆粒細(xì)胞。
　　

11、2.WST方法測定微囊化顆粒細(xì)胞在不同濃度FSH\刺激48小時的OD值，判斷顆粒細(xì)胞微囊化后對FSH刺激后的增殖反應(yīng)。
　　 3.對微囊化卵巢顆粒細(xì)胞進行長期體外培養(yǎng)60天，培養(yǎng)液中添加不同濃度的FSH（0,2.5,25ng/ml），顯微鏡下觀察微囊及微囊內(nèi)細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量的變化，ELISA方法檢測微囊化細(xì)胞培養(yǎng)液上清中中E?和P的分泌情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.結(jié)果顯示所制備的微囊直徑750～800μm，呈

12、規(guī)則球形或橢球形，顆粒細(xì)胞在微囊內(nèi)分布均勻。體外培養(yǎng)60天，微囊形態(tài)保持良好，微囊內(nèi)顆粒細(xì)胞無明顯增多，F(xiàn)SH添加對微囊內(nèi)顆粒細(xì)胞數(shù)量無顯著影響。
　　 2.通過WST方法檢測到，微囊化卵巢顆粒細(xì)胞在體外培養(yǎng)48小時FSH各組間的OD值無顯著性差異（P=0.876）。
　　 3.微囊化的卵巢顆粒細(xì)胞在體外培養(yǎng)的第3,9,15,21,27,33,39,45,51,57和60天E?的分泌水平相似，在各時間點的E?水平差異無顯

13、著性（P=0.184）。不同濃度的FSH對微囊內(nèi)顆粒細(xì)胞分泌E?的影響差異也無顯著性（P=0.481）。但在體外培養(yǎng)的第3天，F(xiàn)SH2.5ng/ml組微囊內(nèi)顆粒細(xì)胞分泌E2水平顯著高于FSH0ng/ml和FSH25ng/ml組，差異有顯著性（P=0.005）。
　　 4.微囊化的卵巢顆粒細(xì)胞在體外培養(yǎng)的第3,9,15,21,27,33,39,45,51,57和60天P的分泌水平不同，差異有顯著性（P=0.002），而不同濃度的F

14、SH對顆粒細(xì)胞分泌P的影響差異無顯著性（P=0.069）。三組微囊化的卵巢顆粒細(xì)胞在培養(yǎng)的第15天時P的分泌增加顯著（P=0.001），在體外培養(yǎng)的第21天達(dá)到分泌的高峰（P﹤0.001），培養(yǎng)的第45天時，P的分泌開始下降，但仍保持穩(wěn)定到培養(yǎng)的第60天。
　　 第三部分：微囊化卵巢顆粒細(xì)胞同種異體腹腔內(nèi)移植對去勢大鼠生殖系統(tǒng)和內(nèi)分泌功能的影響
　　 目的：觀察微囊化卵巢顆粒細(xì)胞異體移植對去勢大鼠血清中E?和P的分泌及子

15、宮內(nèi)膜、陰道脫落細(xì)胞的影響，探討微囊化卵巢顆粒細(xì)胞異體移植作為激素替代治療的可行性。
　　 方法：12周齡成年SD大鼠分為4組，正常大鼠組，單純?nèi)萁M，微囊化卵巢顆粒細(xì)胞移植組、空微囊移植組。SD大鼠去勢4周后腹腔內(nèi)移入微囊化顆粒細(xì)胞和空微囊。移植后對各研究組的大鼠每10天尾靜脈采血一次，分離大鼠血清，ELISA法統(tǒng)一測定血清中E?和P的水平；每天取陰道脫落細(xì)胞，在光鏡下觀察雌激素的影響；移植后60天，大鼠處死，采用HE染色方法

16、對移植后大鼠的子宮進行染色，觀察子宮內(nèi)膜的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.移植后60天，大鼠處死后發(fā)現(xiàn)所移植微囊大部分粘附、包裹在腹腔臟器表面；回收的微囊形態(tài)完整，無破裂，表面被成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等包裹。
　　 2.移植后大鼠體內(nèi)隨移植時間變化，E?分泌水平有顯著性差異（P﹤0.001），各分組間E?分泌水平也有顯著性差異（P=0.001）。微囊化卵巢顆粒細(xì)胞移植組大鼠在移植后的第30天，E?的水平達(dá)最高峰，接

17、近正常組大鼠的E?的水平（P﹥0.05）。微囊化卵巢顆粒細(xì)胞移植組大鼠移植后第30天和第40天的E?的水平顯著高于移植前水平（P=0.001,P=0.021），而其他時間E?的水平與移植前無顯著差異（P﹥0.05）。微囊化卵巢顆粒細(xì)胞移植對去勢大鼠的P分泌無影響。
　　 3.去勢大鼠子宮內(nèi)膜變薄、腺體萎縮，微囊化卵巢顆粒細(xì)胞移植后子宮內(nèi)膜增厚不明顯，但內(nèi)膜內(nèi)出現(xiàn)腺體，腺腔較小。
　　 4.微囊化卵巢顆粒細(xì)胞移植組的陰道脫

18、落細(xì)胞與正常大鼠的發(fā)情前期或發(fā)情后期的表現(xiàn)相似，但無周期性變化。
　　 結(jié)論：
　　 1.卵巢顆粒細(xì)胞微囊化前后均可在體外無血清培養(yǎng)體系中長期存活，并保持內(nèi)分泌功能，可以作為產(chǎn)生內(nèi)源性雌激素來源的細(xì)胞用于細(xì)胞移植。
　　 2.顆粒細(xì)胞微囊化前后，E?分泌量差異顯著，可能與徵囊化過程和微囊材料的生物相容性有關(guān)。
　　 3.FSH對顆粒細(xì)胞促進E?分泌作用顯著，但對微囊化后的顆粒細(xì)胞促進E?分泌作用有限，可能