在體構建組織工程軟骨的實驗研究.pdf

1、第一部分利用一種新型的組織工程室在體構建組織工程軟骨的實驗研究
　　實驗一兔自體耳廓軟骨細胞的分離培養(yǎng)與鑒定的實驗研究
　　[摘要]目的:探討兔耳廓軟骨細胞分離、培養(yǎng)的方法及其傳代過程中細胞形態(tài)、細胞外基質(zhì)的變化。方法：取兔耳廓軟骨采用胰蛋白酶結合Ⅱ型膠原酶消化的方法進行分離、培養(yǎng)及鑒定。結果：原代培養(yǎng)的軟骨細胞呈多角形，第4代開始細胞表型發(fā)生改變。細胞培養(yǎng)3代以內(nèi)，仍能保持表型及生物學特性的穩(wěn)定。結論：采用二種或多種酶聯(lián)合

2、消化的方法可縮短消化時間，提高細胞純度及培養(yǎng)效率；本實驗培養(yǎng)的第2代新西蘭大白兔耳廓軟骨細胞，具備很強的增殖及分泌合成細胞外基質(zhì)的能力，能提供實驗所需的足量軟骨細胞。適用于軟骨組織工程的研究。
　　實驗二體外構建軟骨細胞-支架復合物的實驗研究
　　[摘要]目的：觀察比較膠原凝膠及PLGA膠原凝膠復合支架在體外對兔耳廓軟骨細胞黏附、分化及增殖的效果。方法：構建軟骨細胞/膠原凝膠和軟骨細胞/PLGA膠原凝膠復合物，并進行體外培養(yǎng)

3、觀察。通過大體形態(tài)、組織學、掃描電鏡觀察兩者在體外培養(yǎng)過程中形成軟骨的能力。結果:術后14天，接種在不同支架上的軟骨細胞復合物均形成了白色新生軟骨樣組織；掃描電鏡可見軟骨細胞呈圓形，在支架材料內(nèi)均勻分布，黏附及生長良好，分泌大量的細胞外基質(zhì)；HE切片見復合物中軟骨細胞分布均勻，細胞外基質(zhì)融合成片；甲苯胺藍及番紅“O”細胞外基質(zhì)特異性染色呈陽性。結論：體外培養(yǎng)環(huán)境下，軟骨細胞在膠原凝膠及PLGA凝膠支架材料上都能維持正常生長及合成細胞外基

4、質(zhì)的能力，但是其在體內(nèi)及長期效果還有待于進一步實驗研究。
　　實驗三利用在體組織工程室構建組織工程軟骨的實驗研究
　　[摘要]目的：初步探索我科自主研制的新型多孔硅膠組織工程室內(nèi)滲液微環(huán)境是否能支撐軟骨細胞-支架復合物的存活及生長，構建組織工程軟骨的可行性。方法：將構建好的軟骨細胞-支架復合物置入組織工程室內(nèi)，再植入實驗兔背部皮下，無需和血管溝通；對照組無組織工程室，直接將復合物植入同一實驗兔背部皮下。術后8周進行大體形體觀

5、察、組織學及免疫組織化學染色、RT-PCR檢測。結果：通過大體形體、組織學及免疫組織化學染色、RT-PCR檢測結果，顯示在實驗兔背部皮下組織工程室內(nèi)，構建的軟骨細胞-支架復合物均形成了軟骨樣組織；而直接植入實驗兔背部皮下的復合物最終消失或者形成一纖維化的結節(jié)。結論：本實驗打破了目前大多數(shù)在體組織工程室需要血管化的思路，在具有免疫活性的動物體內(nèi)無需和血管溝通，應用自主研制的新型多孔硅膠組織工程室內(nèi)微環(huán)境成功構建了自體組織工程軟骨，為軟骨組

6、織工程技術過渡到臨床應用提供了理論依據(jù)。
　　第二部分構建無外支架組織工程軟骨修復肋軟骨供區(qū)缺損的實驗研究
　　實驗一兔骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)和鑒定的實驗研究
　　[摘要]目的：探討兔骨髓間充質(zhì)干細胞（bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs）分離、培養(yǎng)及其鑒定的方法。方法：應用密度梯度離心和貼壁篩選法分離、培養(yǎng)兔BMSCs，觀察兔BMSCs的生長特點、形態(tài)學特征，體外經(jīng)成軟骨、成脂

7、肪和成骨誘導液分別誘導BMSCs向軟骨、脂肪和骨細胞分化。并進行甲苯胺藍、油紅“O”及茜素紅染色。結果：采用密度梯度離心和貼壁篩選相結合的方法，可以簡單有效地獲取大量高純度，增殖能力強的BMSCs，可以向軟骨、骨、脂肪等細胞成功分化。結論：采用密度梯度離心和貼壁篩選相結合的方法是培養(yǎng)兔BMSCs簡便有效的方法，可以滿足進一步實驗的要求。
　　實驗二BMSCs膜片的構建及其成軟骨誘導的實驗研究
　　[摘要]目的：探討應用連續(xù)培

8、養(yǎng)及簡單的機械方法，培養(yǎng)獲取BMSCs膜片，并在體外向軟骨細胞定向誘導。方法：將兔BMSCs在成軟骨誘導條件下，連續(xù)培養(yǎng)14天，用細胞刮刀沿培養(yǎng)皿底壁外周向中心仔細刮擦，獲得完整的細胞膜片。經(jīng)組織學、電鏡等方法檢測細胞膜片的理化特性。結果：應用連續(xù)培養(yǎng)及細胞刮刀可獲得完整的BMSCs膜片。在成軟骨誘導培養(yǎng)條件下，BMSCs仍快速增殖，形成的細胞膜片經(jīng)HE染色顯示其由6-8層細胞組成，甲苯胺藍、番紅“O”染色呈陽性；電鏡下可見細胞分布均勻

9、、緊密排列，分泌細胞外基質(zhì)。結論：通過連續(xù)培養(yǎng)及簡單的機械方法可以有效獲取BMSCs膜片，BMSCs膜片具有體外成軟骨分化的潛能，有望用來構建組織工程軟骨。
　　實驗三成軟骨誘導BMSCs膜片修復肋軟骨供區(qū)缺損的實驗研究
　　[摘要]目的：采用兔胸廓損傷動物模型，觀察成軟骨誘導的BMSCs膜片對肋軟骨供區(qū)再生修復的影響。方法：16只實驗兔隨機分成4組（每組4只）。切取各實驗組兔雙側(cè)4-6肋一段肋軟骨，缺損部位采取3種不同方法

10、處理，①不縫合軟骨膜；②BMSCs膜片折疊數(shù)層成圓筒狀填塞入肋軟骨缺損處縫合；③成軟骨誘導的BMSCs膜片同法折疊數(shù)層成圓筒狀填塞入肋軟骨缺損處，縫合封閉缺損，3種方法在各實驗組兔兩側(cè)肋軟骨中兩兩配對，健康對照組不做處理。術后16周后處死動物取材進行大體觀察，常規(guī)HE染色，測量各實驗組兔肋軟骨的平均寬度，并行生物力學檢測測定所有肋軟骨的抗壓強度及彎曲強度。結果：各實驗組家兔的胸廓整體形態(tài)均較良好，各組及各處理方法之間并無明顯差別。方法1

11、處理的修復組織平均寬度顯著大于健康對照組肋軟骨的平均寬度(P<0.01)，方法2、3處理的修復組織平均寬度與健康對照組肋軟骨平均寬度相比無顯著性差異(P>0.05)；生物力學檢測顯示：3種處理方法之間均存在差異(P<0.01)，方法3處理的修復組織的抗壓、彎曲強度與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），方法1，2處理的修復組織的抗壓、彎曲強度明顯低于健康對照組(P<0.01)，方法2處理的修復組織的抗壓、彎曲強度優(yōu)于方法1；組