軟骨組織工程種子細胞應用策略及耳廓軟骨組織構建研究.pdf

1、研究背景及意義：
　　 耳廓軟骨組織工程為耳軟骨缺損的修復重建提供了新的治療思路，其中種子細胞是限制其發(fā)展及臨床應用的瓶頸之一。目前，構建組織工程軟骨主要通過三種方式來實現：(1)單獨應用各種來源的軟骨細胞；(2)單獨應用成軟骨誘導后的間充質干細胞（Mesenchymalstemcells，MSCs）；(3)將軟骨細胞與MSCs混合共培養(yǎng)。上述三類種子細胞應用方案從細胞生物學基礎與臨床應用的角度上講各存利弊，但目前尚缺乏關于此類

2、問題的深入探討；此外，針對先天性小耳畸形，自體殘耳組織是外耳重建重要的種子細胞來源，目前對殘耳組織來源細胞及其軟骨構建系統(tǒng)化的研究較少，確立最佳的種子細胞應用策略能夠為耳廓軟骨組織工程突破目前困境及發(fā)展未來應用提供理論基礎和技術支持。
　　 研究目的：
　　 1、通過在組織學、基因表達及生物學功能等方面系統(tǒng)比較單純應用軟骨細胞、軟骨細胞與BMSCs混合共培養(yǎng)、BMSCs成軟骨誘導三類種子細胞應用方案，確立構建彈性軟骨最佳

3、的種子細胞應用策略并探討其構建耳廓形態(tài)軟骨的可行性。
　　 2、通過分析殘耳軟骨細胞的體外增殖、表型變化、細胞組織的量效關系以及研究傳代、誘導對其體內成軟骨能力的影響，確立基于殘耳軟骨細胞的種子細胞應用策略及其構建耳廓形態(tài)軟骨的可行性。
　　 研究內容：
　　 1．不同種子細胞及應用方案構建組織工程軟骨
　　 1.1、比較不同組織來源軟骨細胞構建組織工程軟骨的差異
　　 方法：選擇耳廓和關節(jié)兩種不

4、同組織來源的軟骨細胞接種PGA/PLA支架構建組織工程軟骨組織，在其體外和體內的不同構建階段，通過組織學檢測進行觀察，比較兩組構建物是否因細胞的組織來源不同而存在差異。
　　 結果：耳廓和關節(jié)來源的軟骨細胞構建的軟骨組織在體外未發(fā)現組織學水平的差異，但植入皮下6周后均恢復了各自的生物學特性，關節(jié)軟骨細胞組發(fā)生了部分骨化，耳廓軟骨細胞組出現了彈性纖維的陽性著色。
　　 小結：體外構建的組織工程軟骨植入體內后能恢復軟骨細胞組

5、織來源的特性，可在皮下構建與軟骨細胞來源類型相同的組織工程軟骨。
　　 1.2、比較三類種子細胞應用方案構建組織工程軟骨的差異
　　 方法：系統(tǒng)性比較單獨應用耳廓軟骨細胞、單獨應用骨髓間充質干細胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)并對其進行成軟骨誘導、以及耳廓軟骨細胞與BMSCs混合共培養(yǎng)構建的組織工程軟骨在組織學、基因表達及生物力學功能方面存在的差異。
　　 結果：復合

6、物在植入體內6周后，BMSCs誘導組不僅不能構建彈性軟骨組織而且發(fā)生了明顯的骨化，COL10A1、MMP13、ALPL的表達較其余兩組出現顯著升高；耳廓軟骨細胞與BMSCs混合共培養(yǎng)組不僅可保持穩(wěn)定的軟骨表型，而且相較單純耳廓軟骨細胞組其彈性纖維更為均質、密集，彈性模量也更高且與生理耳廓軟骨無統(tǒng)計學差異，COL9A1、COMP、DCN、LOXL2的表達也有統(tǒng)計學意義的升高。此外，共培養(yǎng)構建的軟骨組織其Dlk1與Ki67的表達也高于單純耳

7、廓軟骨細胞組。
　　 小結：耳廓軟骨細胞與BMSCs混合共培養(yǎng)是目前構建彈性軟骨組織最佳的種子細胞應用策略，其構建的彈性軟骨具備更密集的彈性纖維和更高的彈性模量，并且可延續(xù)干細胞帶來的增殖與分化能力。
　　 1.3、軟骨細胞與骨髓間充質干細胞共培養(yǎng)構建耳廓軟骨
　　 方法：將豬自體耳廓軟骨細胞與BMSCs以5∶5的比例混合接種于預成型的耳廓形態(tài)PGA/PLA支架上，體外培養(yǎng)10周，植入豬耳后皮下20周后進行軟骨相

8、關檢測。
　　 結果：豬耳廓軟骨細胞與BMSCs以5∶5的比例混合共培養(yǎng)能夠在體外構建良好形態(tài)及彈性的耳廓軟骨，在植入大動物體內20周后仍然能夠穩(wěn)定存活，且其組織學與彈性相較生理耳廓軟骨無明顯差異，但是最終難以維持耳廓的精細形態(tài)。
　　 小結：在大動物體內實驗中，共培養(yǎng)構建的耳廓軟骨能夠穩(wěn)定存活20周，但因不能對抗皮膚收縮力最終難以維持耳廓的精細形態(tài)。
　　 2．先天性小耳殘耳軟骨細胞構建組織工程軟骨
　　

9、 2.1、殘耳軟骨細胞的增殖、表型變化及量效關系研究
　　 方法：通過對大量殘耳組織進行稱重和細胞分離計數，計算殘耳組織的初始細胞獲得率；通過繪制生長曲線和細胞計數研究4代以內殘耳軟骨細胞在bFGF影響下的增殖能力及擴增倍數；在細胞和基因水平檢測傳代對殘耳軟骨細胞表型的影響；并通過大量軟骨相關基因譜的篩查比對殘耳軟骨細胞與正常耳軟骨細胞在基因水平的異同。
　　 結果：殘耳組織的初始細胞獲得率為(3.90±1.27)×1

10、06/g;殘耳軟骨細胞在bFGF的刺激下增殖能力明顯提高,4代以內增殖能力未見差別，且擴增至P4代能夠達到(328.4±50.4)倍的增殖效率；但是，同樣條件下擴增至P3代的殘耳軟骨細胞其番紅O染色、Ⅱ型膠原的基因表達已較弱，至P4代基本檢測不到；此外，殘耳軟骨細胞在基因水平除個別個體的COL2A1成熟型異構體COL2A1V2及COL9A1的表達偏低外，與正常耳軟骨細胞相較未見明顯差異。
　　 小結：殘耳組織來源細胞與正常耳廓軟

11、骨細胞相比在基因水平未見明顯差異，在bFGF培養(yǎng)下增殖到P3代仍可維持一定程度的軟骨表型且能達到構建常人體積耳廓軟骨的細胞數量（以獲得500mg殘耳組織計算）。
　　 2.2、體外傳代及誘導對殘耳軟骨細胞體內成軟骨能力的影響
　　 方法：將P3-P8代殘耳軟骨細胞各自接種PGA/PLA支架進行軟骨組織構建，根據組織學、基因表達和生物力學結果分析體外傳代及誘導對其最終體內成軟骨能力的影響。
　　 結果：在P3-P8

12、各代次細胞材料復合物中，P4代以前在體外4周可較高表達SOX9和DLK1，并能在體內形成良好的彈性軟骨組織；經過體外誘導，P3-P8代的殘耳軟骨細胞材料復合物均能在體外形成類軟骨組織，但DLK1的表達卻均顯著低于非誘導組，且其體內8周后的成骨現象十分明顯。
　　 小結：P4代以前的殘耳軟骨細胞不經體外誘導雖然不能在體外構建耳廓軟骨，但仍可保持良好的體內成軟骨能力形成彈性軟骨。P3-P8代細胞經體外誘導可以形成類軟骨組織，但是其體

13、內的成骨傾向較為嚴重，DLK1可能在體外成軟骨誘導致體內成骨過程中扮演重要角色。
　　 2.3、單例先天性小耳殘耳軟骨細胞構建常人體積耳廓軟骨
　　 方法：將單例病人殘耳組織分離的軟骨細胞在體外傳至P3或P4代，在生長因子、藻酸鹽凝膠、旋轉培養(yǎng)的體外再分化系統(tǒng)中培養(yǎng)10周后進行軟骨相關檢測，以體外普通培養(yǎng)（不誘導）作為對照。
　　 結果：利用單例先天性小耳的殘耳組織經過細胞擴增和再分化系統(tǒng)培養(yǎng)可以在體外構建常人體

14、積的耳廓形態(tài)軟骨，所形成的軟骨組織結構較接近正常生理軟骨組織。
　　 小結：大量增殖的殘耳軟骨細胞在再分化誘導系統(tǒng)培養(yǎng)下能夠在體外構建常人體積的耳廓軟骨。
　　 綜上所述，本研究以耳廓軟骨構建為最終目的，探討了幾種軟骨組織工程種子細胞及其應用策略的可行性。明確了耳廓軟骨細胞與BMSCs共培養(yǎng)方案在構建彈性軟骨方面的優(yōu)勢，首次應用其在體外構建耳廓形態(tài)組織工程軟骨并進行大動物體內研究。同時，系統(tǒng)研究了殘耳軟骨細胞構建軟骨組織