以小耳殘耳軟骨細(xì)胞為種子細(xì)胞的組織工程軟骨的實驗研究.pdf

1、第一部分：小耳殘耳軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究 目的：研究人的小耳殘耳軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法及細(xì)胞的生物學(xué)特性。 方法：取5～6歲小耳畸形患者的殘耳軟骨，采用0.1％的Ⅱ型膠原酶消化后，接種于含有胎牛血清的Ham F-12培養(yǎng)基，進(jìn)行體外培養(yǎng)，同時觀察其形態(tài)學(xué)改變。采用Ⅱ型膠原抗體的免疫組化染色進(jìn)行細(xì)胞來源的鑒定，RT-PCR檢測各代細(xì)胞Ⅱ型膠原和Aggrecan mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：體外培養(yǎng)的小耳殘耳

2、軟骨細(xì)胞的原代和早期傳代細(xì)胞以多角形或者三角形為主，隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞逐漸變?yōu)殚L梭形，到第5代時，幾乎全部轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮渭?xì)胞。而且與正常耳廓軟骨細(xì)胞相比，小耳殘耳軟骨細(xì)胞去分化的現(xiàn)象更為顯著。第1-3代軟骨細(xì)胞的Ⅱ型膠原抗體免疫組化染色陽性。在第1～2代細(xì)胞中，Ⅱ型膠原和Aggrecan的mRNA表達(dá)水平較強，隨傳代次數(shù)增加，表達(dá)逐漸減弱，至第4代基本消失。 結(jié)論：體外培養(yǎng)的第1～2代小耳畸形患者的殘耳軟骨細(xì)胞可作為組織工程軟

3、骨的種子細(xì)胞。 第二部分：不同年齡患者的小耳殘耳軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)及其生物學(xué)特性研究 目的：觀察年齡因素對體外培養(yǎng)的小耳殘耳軟骨細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。 方法：取不同年齡組小耳畸形患者的殘耳軟骨，分離出軟骨細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)，觀察其形態(tài)學(xué)改變，測定細(xì)胞群體培增的時間。Ⅱ型膠原抗體的免疫組化染色進(jìn)行細(xì)胞來源的鑒定。采用RT-PCR對各年齡組小耳殘耳軟骨細(xì)胞的Ⅱ型膠原和Aggrecan mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測，并進(jìn)行比較。

4、 結(jié)果：各年齡組小耳畸形患者的殘耳軟骨細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞倍增時間、Ⅱ型膠原和Aggrecan mRNA的表達(dá)方面均無顯著差異。體外培養(yǎng)的小耳殘耳軟骨細(xì)胞隨著傳代次數(shù)的增加，從多角形逐漸變?yōu)殚L梭形。到第5代時，幾乎全部轉(zhuǎn)變成梭形細(xì)胞。細(xì)胞倍增時間顯示，各年齡組的第1～3代細(xì)胞有旺盛的增殖力。各年齡組第1～3代細(xì)胞的免疫組織化學(xué)染色均為陽性，1代和第2代細(xì)胞的Ⅱ型膠原和Aggrecan的mRNA表達(dá)水平相對較高，第3代的表達(dá)明顯下降，

5、第4代起均不表達(dá)。 結(jié)論：體外培養(yǎng)的人小耳殘耳軟骨細(xì)胞的生物學(xué)特性不因年齡不同(6～30歲)而改變，各年齡段(＜30歲)的第1和第2代小耳殘耳軟骨細(xì)胞可作為軟骨組織工程的種子細(xì)胞。 第三部分： 堿性成纖維細(xì)胞生長因子在小耳殘耳軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)中的作用 目的：觀察堿性成纖維細(xì)胞生長因子(b-FGF)對體外培養(yǎng)的小耳殘耳軟骨細(xì)胞增殖的影響。 方法：取小耳畸形患者的殘耳軟骨，用含5 ng/ml、10 ng/ml

6、、25 ng/ml和50 ng/ml4種濃度b-FGF的Ham F-12培養(yǎng)液進(jìn)行體外培養(yǎng)。采用MTT法觀察b-FGF對細(xì)胞增殖的影響，RT-PCR法檢測b-FGF對體外培養(yǎng)的小耳殘耳軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原和Aggrecan分泌方面影響。 結(jié)果：在含有b-FGF的培養(yǎng)液中培養(yǎng)的小耳殘耳軟骨細(xì)胞呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣貼壁生長，細(xì)胞的增殖速度明顯加快(P＜0.05)，但在10 ng/ml、25 ng/ml和50 ng/ml3種不同濃度b-FGF

7、組之間，細(xì)胞增殖無顯著差異(P＞0.05)，RT-PCR結(jié)果顯示，各組的第3代軟骨細(xì)胞仍存在Ⅱ型膠原和Aggrecan的表達(dá)。 結(jié)論：b-FGF能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的小耳殘耳軟骨細(xì)胞增殖，在2代之內(nèi)，細(xì)胞的表型和功能并沒有改變。10 ng/ml為b-FGF在小耳殘耳軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)中的最佳濃度。 第四部分：小耳殘耳軟骨細(xì)胞為種子細(xì)胞的組織工程軟骨的實驗研究 目的：探討利用小耳畸形患者的殘耳軟骨細(xì)胞為種子細(xì)胞，在裸鼠體

8、內(nèi)構(gòu)建組織工程軟骨的可行性。 方法：獲取小耳畸形患者的殘耳軟骨，并以正常耳廓軟骨作為對照，用含10 ng/ml b-FGF的培養(yǎng)液分別進(jìn)行體外培養(yǎng)。將體外培養(yǎng)擴(kuò)增的第2代小耳殘耳軟骨細(xì)胞以及正常耳廓軟骨細(xì)胞以50×106/ml的濃度與30％的Pluronic F-127混勻，分別注入到裸鼠的皮下，在8周時將標(biāo)本分離取出，通過大體觀察、組織學(xué)、免疫組織化學(xué)染色等方法對新生成的軟骨進(jìn)行初步的評價。 結(jié)果：組織學(xué)檢測顯示，兩種