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文檔簡介
1、目的:
對低溫凍存異體軟骨種子細胞構(gòu)建的工程化軟骨用于修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)缺損進行大體和組織形態(tài)學(xué)觀察。從而探討低溫凍存異體軟骨細胞作為軟骨組織工程種子細胞修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的可行性及效果,為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
方法:
體外實驗:取用慢速梯度降溫法保存的健康成年新西蘭兔雙膝關(guān)節(jié)軟骨原代種子細胞,37℃水浴中復(fù)溫2分鐘。取一定量的經(jīng)濾膜除菌的海藻酸納混懸液加入精確計數(shù)的軟骨種子細胞,充分吹打混勻,種植密
2、度為4×107/ml,然后在硅膠盤模上制備細胞盤,加入質(zhì)量分數(shù)為1.06%的Cacl2液凝膠化10min,DMEM/F12無血清培養(yǎng)基加20%胎牛血清于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)2周。分別于1、2、4、6、8、10、12、14天分別取3個完整的細胞盤,取均數(shù)繪制軟骨細胞的生長曲線。于培養(yǎng)2周取材,切片行HE染色,觀察軟骨細胞的分布、形態(tài)。
體內(nèi)實驗:同時選用成年新西蘭大白兔27只,用電鉆在股骨的髕股關(guān)節(jié)面中心造成直徑3.0mm,深
3、3.0mm的全層軟骨缺損模型,隨機在缺損處植入體外培養(yǎng)2周的軟骨細胞.海藻酸鈉盤(A組)及無細胞的海藻酸鈉載體(B組),空白組不做處理(C組)。分別于術(shù)后4、8、12周采用空氣栓塞法分批處死動物后取材,行大體觀察,HE、甲苯胺藍染色及免疫組織化學(xué)分析觀察。進行Wakitani組織學(xué)評分,觀察在體內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)效果。
數(shù)據(jù)以均數(shù)士標準差((x-)±s)表示,用SAS8.1統(tǒng)計軟件包進行分析,采用雙因素方差分析進行實驗效應(yīng)
4、和時間效應(yīng)的分析,并用LSD-t檢驗進行組間多重比較,P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。
結(jié)果:
1.軟骨細胞盤內(nèi)軟骨細胞的觀察與檢測:軟骨種子細胞在海藻酸鈉支架內(nèi),于培養(yǎng)4天后開始增殖,2周時繼續(xù)增量生長,并形成工程化軟骨。
2.移植處大體觀察:術(shù)后三組觀察,關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜均無充血、水腫,無關(guān)節(jié)液的異常,關(guān)節(jié)囊無粘連。術(shù)后12周時,A組修復(fù)缺損組織與周圍正常軟骨組織很難區(qū)分,與周圍正常組織無明顯界限,顏
5、色接近,表面光滑,色澤一致,按壓彈性一致。其余兩組均可見缺損處未完全修復(fù),有凹陷,按壓略有彈性,低于周圍軟骨組織,未見軟骨組織,與周圍組織有明顯差別。
3.移植處組織學(xué)觀察:術(shù)后12周時,A組以透明軟骨修復(fù)為主。免疫組化示軟骨細胞呈陽性,甲苯胺藍染色示軟骨組織膠原基質(zhì)的合成與分泌功能旺盛。缺損部位修復(fù)面基本平整,修復(fù)組織和周圍軟骨整合緊密,基本無差異。整個觀察期,未見血管及淋巴侵入。其余兩組缺損區(qū)以纖維組織填充為主,略有凹
6、陷,未能完全修復(fù)。甲苯胺藍染色及免疫組化,B組之見少量軟骨細胞表達,C組未見軟骨細胞表達,細胞外基質(zhì)與Ⅱ型膠原未見表達。
4.Wakitani組織學(xué)評分及統(tǒng)計學(xué)分析,示A組與其余兩組的修復(fù)效果有顯著性差異(P<0.05)。
結(jié)論:
1.通過慢速梯度降溫法保存的軟骨細胞可以作為軟骨組織工程的種子細胞。
2.海藻酸鈉是一種比較理想的支架材料,軟骨細胞一海藻酸鈉復(fù)合物體在外培養(yǎng)可生成工程
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