組織工程椎間盤的構(gòu)建與動物實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：以人胚胎椎間盤細(xì)胞為種子細(xì)胞，以PLGA材料為支架構(gòu)建組織工程椎間盤。通過對人胚胎椎間盤細(xì)胞復(fù)合多孔支架進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫組織化學(xué)研究，結(jié)合對椎間盤細(xì)胞與框架在體內(nèi)、外的相互作用，不同復(fù)合細(xì)胞數(shù)量對人胚胎椎間盤細(xì)胞復(fù)合多孔支架影響的研究，構(gòu)建與天然椎問盤生理功能相似的組織工程椎間盤并探索構(gòu)建組織工程椎間盤的合適細(xì)胞接種數(shù)量。 方法：(1)以純化的PLGA為原料，通過熱致相分離方法，制備成孔徑50～300μm的

2、球孔式結(jié)構(gòu)。(2)從20周齡流產(chǎn)胎兒分離培養(yǎng)椎間盤細(xì)胞，傳2代后接種于PLGA支架，通過MTT攝取、掃描電鏡的方法進(jìn)行體外觀察，判斷細(xì)胞與支架的復(fù)合情況及細(xì)胞的增殖、合成功能狀況。(3)分別構(gòu)建細(xì)胞接種數(shù)量為10<'6>(A組)、10<'5>(B組)、10<'4>(C組)及單純支架(D組)的組織工程椎間盤各10個(gè)，每一支架需150μl細(xì)胞懸液。體外培養(yǎng)48小時(shí)后植入裸鼠背部皮下，4周后取材觀察。通過形態(tài)觀察、組織學(xué)觀察、免疫組織化學(xué)染色

3、、糖胺聚糖的生化測定比較不同細(xì)胞接種數(shù)量的復(fù)合物功能情況從而選擇合適的細(xì)胞接種數(shù)量。 結(jié)果：(1)熱致相分離方法可將純化PLGA原料制成PLGA多孔支架。所得的支架孔隙率較高，孔壁較薄，孔隙直徑50～300μm，孔隙由中心向外呈放射狀分布，孔隙形態(tài)、取向規(guī)則有序。(2)原代胎兒椎間盤細(xì)胞生長迅速，隨傳代次數(shù)增加，細(xì)胞極性逐漸增強(qiáng)，生長變緩；細(xì)胞.支架復(fù)合物加入MTT培養(yǎng)4小時(shí)后出現(xiàn)較為明顯的顯色反應(yīng)。顏色隨接種細(xì)胞數(shù)量增加而有明

4、顯的加深，C組復(fù)合物表現(xiàn)為均勻的淡紫色，B組復(fù)合物較前一結(jié)果有所加深并出現(xiàn)數(shù)個(gè)顆粒狀深染區(qū)，而A組復(fù)合物呈現(xiàn)出均勻、濃密的深紫色；細(xì)胞.支架復(fù)合物體外培養(yǎng)48h后掃描電鏡下即可見大量細(xì)胞貼附于支架內(nèi)，并可觀察到少量細(xì)胞外基質(zhì)合成。(3) 3月齡裸鼠切開皮膚后皮膚與皮下組織分離較為簡單，可順利將支架植入皮下并縫合，所有皮膚縫線均在手術(shù)后兩周內(nèi)脫落，切口愈合良好；體內(nèi)植入4周后，細(xì)胞-支架復(fù)合物仍保持其原有形狀，而單純支架植入組支架材料明顯

5、皺縮；細(xì)胞-支架復(fù)合物切片HE染色可見A組復(fù)合物內(nèi)細(xì)胞數(shù)量明顯高于其余兩組實(shí)驗(yàn)組，A組及B組復(fù)合物內(nèi)細(xì)胞多呈橢圓形或短梭形，而C組復(fù)合物內(nèi)細(xì)胞極性明顯增強(qiáng)，細(xì)胞呈長梭形沿支架生長，細(xì)胞外基質(zhì)成分較少；免疫組化染色各實(shí)驗(yàn)組復(fù)合物均可觀察到人Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白的合成，通過光密度對比分析，A及B組復(fù)合物Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)量明顯高于C組，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而在Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)上，各組間無明顯差別；BrdU染色檢測證實(shí)實(shí)驗(yàn)組復(fù)合物

6、內(nèi)細(xì)胞為BrdU陽性細(xì)胞；A組及B組復(fù)合物內(nèi)GAG的含量明顯高于C組復(fù)合物，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：(1)PLGA支架具有良好的生物相容性，是構(gòu)建組織工程椎間盤的合適選擇；人胎兒椎間盤細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下可與PLGA支架完成良好的立體結(jié)合，細(xì)胞可順利完成貼附及增殖。(2)A組及B組復(fù)合物合成Ⅱ型膠原及糖胺聚糖的能力明顯優(yōu)于C組，因此，A組及B組復(fù)合物有可能對退變椎間盤的修復(fù)起到促進(jìn)作用。(3)構(gòu)建組織工程椎間盤比較理想的細(xì)胞接