異體椎間盤復(fù)合表達(dá)外源性hBMP7因子的髓核細(xì)胞構(gòu)建組織工程椎間盤的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、椎間盤退變是引起成人腰腿痛、頸肩痛的主要原因。隨著人均壽命的延長和社會(huì)工作壓力增大,椎間盤退變性疾病的發(fā)病率明顯升高，而目前的保守治療和外科手術(shù)治療均不能從根本上，解決患者的病情。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床初步應(yīng)用證明，椎間盤移植后可以異體存活，并能完全緩解患者的臨床癥狀，就其生物力學(xué)方面亦可滿足生理活動(dòng)需要，但植入的異體椎間盤在生化代謝及組織學(xué)上有明顯的退行性改變，這將導(dǎo)致臨床癥狀的再次出現(xiàn)，并可能出現(xiàn)椎間盤活動(dòng)度消失等并發(fā)癥。最近的研究結(jié)果

2、顯示椎間盤內(nèi)細(xì)胞活性的提高能延緩甚至阻止椎間盤退變性改變。因此本實(shí)驗(yàn)擬通過以異體椎間盤為支架材料，以表達(dá)外源性人BMP7的髓核細(xì)胞為種子細(xì)胞，體外構(gòu)建組織工程椎間盤，并觀察組織工程椎間盤的生物活性及功能情況。
　　1.深低溫儲存溫度及時(shí)間對異體椎間盤生物活性的影響
　　目的：探討不同的深低溫儲存溫度及儲存時(shí)間對異體椎間盤生物活性影響，獲得最適合臨床應(yīng)用的保存條件。
　　方法：取犬椎間盤52只，分為對照組、液氮保存組和-

3、80℃保存組。在冷凍保存液中分別儲存于液氮及-80℃低溫冰箱中，在儲存的2w、1m、2m、4m、6m及12m時(shí)，通過EB/FAD法檢測椎間盤組織中不同部位的細(xì)胞存活率，以DMMB法檢測髓核組織蛋白多糖（PG）含量，以羥脯氨酸法檢測髓核組織中的總膠原含量。
　　結(jié)果：各檢測時(shí)間點(diǎn)兩組間外層纖維環(huán)細(xì)胞活性明顯高于內(nèi)層纖維環(huán)及髓核組織（p<0.05）,內(nèi)層纖維環(huán)及髓核組織間細(xì)胞活性未見明顯不同；在內(nèi)層纖維環(huán)及髓核組織中，細(xì)胞存活率在儲存

4、2w時(shí)，可見液氮組明顯高于-80℃組（p<0.05)，自儲存1月起至12個(gè)月，兩組間均無明顯差別(p>0.05)。在儲存期間兩儲存組蛋白多糖含量均逐漸降低，在1m至12m儲存期間，液氮保存組蛋白多糖含量均高于-80℃保存組。而兩組間總膠原蛋白含量在儲存期間隨時(shí)間逐漸降低，但兩組間未見明顯差異。
　　結(jié)論：利用液氮保存椎間盤組織，無論在細(xì)胞總的存活率及PG含量上均優(yōu)于-80℃，1年的液氮保存期間，細(xì)胞存活率及功能蛋白PG含量均在一個(gè)

5、恒定的水平，能滿足異體椎間盤移植的基本要求，可作為組織工程椎間盤的支架材料。
　　2.重組腺相關(guān)病毒人BMP7(rAAV2-hBMP7)病毒載體的構(gòu)建及鑒定
　　目的:探討能否利用pSNAV2.0質(zhì)粒構(gòu)建系統(tǒng)構(gòu)建pSNAV2.0-hBMP7穿梭質(zhì)粒，并包裝純化成可供實(shí)驗(yàn)用rAAV-hBMP7病毒載體。
　　方法：利用AgeI和NheI酶切pDC316-hBMP7-IRES-EGFP質(zhì)粒，回收純化hBMP7基因片段，以A

6、geI和NheI酶切載體質(zhì)粒pSNAV2.0-LacZa，回收純化pSNAV2.0載體質(zhì)粒片段，利用T4DNA連接酶將純化回收的hBMP7基因與pSNAV2.0載體質(zhì)粒片段連接構(gòu)建，并轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH-5α進(jìn)行擴(kuò)增純化，測序鑒定；用Lipofectamine2000將序列正確的pSNAV2.0-hBMP7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞，G418選擇培養(yǎng)，并大量擴(kuò)增至所需并用HSV1-rc/ΔUL2輔助病毒感染，以PEG8000/Na

7、Cl沉淀，以氯仿純化濃縮、檢測滴度及純度。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建了pSNAV2.0-hBMP7質(zhì)粒，經(jīng)PCR、酶切和測序鑒定構(gòu)建正確。利用Lipofectamine2000將序列正確的pSNAV2.0-hBMP7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞，并通過含有G418的培養(yǎng)基，選擇性擴(kuò)增，并濃縮純化出了滴度達(dá)5.1×1011v.g、純度>97％的rAAV-hBMP7病毒載體。
　　結(jié)論：利用pSNAV2.0質(zhì)粒包轉(zhuǎn)系統(tǒng)能成功將外源性基因

8、hBMP7包裝成滴度及純度滿足實(shí)驗(yàn)要求的rAAV-hBMP7病毒載體。
　　3.介導(dǎo)人骨形成蛋白-7的2型腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞及其對髓核細(xì)胞表型的影響
　　目的：以介導(dǎo)外源性人骨形成蛋白-7（hBMP7）基因的2型腺相關(guān)病毒（recombinant adeno-associated virus type-2，rAAV2）載體轉(zhuǎn)染犬髓核細(xì)胞（canine nucleus pulposus cell,cNPcell），觀察轉(zhuǎn)染

9、后髓核細(xì)胞hBMP7蛋白表達(dá)，并分析髓核細(xì)胞生物功能變化。
　　方法：實(shí)驗(yàn)組以最佳感染復(fù)數(shù)（MOI）1×105vg/cell轉(zhuǎn)染犬髓核細(xì)胞，對照組以相同MOI的不含hBMP7基因的rAAV2-EGFP病毒感染。在轉(zhuǎn)染后4d、7d和14d分別以RT-PCR、Wensten bloting方法分別對兩組髓核細(xì)胞中hBMP7的mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測。在轉(zhuǎn)染后的第7天，檢測兩組細(xì)胞增殖能力。在轉(zhuǎn)染后的4、7和14d，利用real-

10、timePCR、DMMB及Elisa法分別檢測蛋白多糖、Ⅰ和Ⅱ膠原的mRNA含量、蛋白多糖含量及Ⅰ和Ⅱ型膠原蛋白含量。
　　結(jié)果：在以1×105vg/cell轉(zhuǎn)染犬髓核細(xì)胞后，在4d、7d和14d時(shí)均可檢測到實(shí)驗(yàn)組髓核細(xì)胞中高表達(dá)hBMP7mRNA，而對照組，無論在何時(shí)間點(diǎn)均不能檢測到hBMP7mRNA的轉(zhuǎn)錄，半定量分析顯示，7d時(shí)mRNA含量較高。Westen bloting蛋白檢測結(jié)果顯示：7d、14d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組均可檢測到分子

11、量為55kd特異性hBMP7蛋白的表達(dá)，而對照組均未觀察到陽性蛋白條帶。半定量分析顯示：轉(zhuǎn)染后7d時(shí)hBMP7蛋白含量相對較高。在轉(zhuǎn)染7天后，轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力未見明顯區(qū)別。對實(shí)驗(yàn)組髓核細(xì)胞的Real-timePCR定量分析發(fā)現(xiàn)：蛋白多糖、Ⅱ型膠原mRNA在轉(zhuǎn)染后第4天無明顯增加，但在第7天和14天均明顯增高。而Ⅰ型膠原mRNA在4、7和14天均未見明顯變化。實(shí)驗(yàn)組蛋白多糖含量第4天未見明顯變化，而第7、14天較對照組分別增高

12、42％及77％。而Ⅰ膠原含量兩組間未見明顯增加，實(shí)驗(yàn)組Ⅱ型膠原含量在第4天未見明顯增加，而第7、14天分別較對照組增高63％及94％。
　　結(jié)論:rAAV2-hBMP7病毒載體能有效地轉(zhuǎn)染犬髓核細(xì)胞并長期穩(wěn)定表達(dá)人骨形成蛋白-7，并能提高犬髓核細(xì)胞蛋白多糖及Ⅱ型膠原含量，這將能為組織工程椎間盤提供可選擇的基因修飾的種子細(xì)胞。
　　4.組織工程椎間盤的體外構(gòu)建
　　目的：探討利用液氮儲存異體椎間盤及表達(dá)外源性人BMP7的

13、髓核細(xì)胞體外構(gòu)建組織工程椎間盤的方法
　　方法：取儲存于液氮中2個(gè)月的犬椎間盤24只，分為EGFP對照組、1×104、1×105和1×106四組，每組6只。對照組用16G注射器自椎間盤后正中注入1×105的表達(dá)EGFP的髓核細(xì)胞20ul,1×104組注入PKH-26標(biāo)記的表達(dá)hBMP7的髓核細(xì)胞20ul，其總細(xì)胞數(shù)為1×104，1×105組為總細(xì)胞數(shù)1×105的PKH-26標(biāo)記的表達(dá)hBMP7的髓核細(xì)胞20ul，1×106組為細(xì)胞

14、總數(shù)1×106的PKH-26標(biāo)記的表達(dá)hBMP7的髓核細(xì)胞20ul。注射后立即置入50ml離心管中，加入30ml完全培養(yǎng)基，分別于培養(yǎng)4、7、14天，從椎間盤形態(tài)、細(xì)胞存活、及髓核細(xì)胞熒光強(qiáng)度、蛋白多糖及膠原含量等方面進(jìn)行評價(jià)。
　　結(jié)果：在儲存的第4天及7天，椎間盤外形基本未見明顯改變，而在儲存至14天時(shí)，可見椎間盤上下終板有鈣質(zhì)脫落。在各時(shí)間點(diǎn)均可見表達(dá)綠色熒光蛋白髓核細(xì)胞。對不同組、不同時(shí)間點(diǎn)的組織工程椎間盤中熒光強(qiáng)度定量后

15、發(fā)現(xiàn)：培養(yǎng)第7和14天時(shí)，1×105組熒光強(qiáng)度明顯高于1×106組和1×104組。而且1×105組培養(yǎng)第7和14天時(shí)蛋白多糖及總膠原含量均較另外三組明顯增高。
　　結(jié)論：利用液氮儲存異體椎間盤同1×105轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞復(fù)合，體外培養(yǎng)7天能構(gòu)建出較理想的組織工程椎間盤。
　　小結(jié)：
　　1.利用液氮保存椎間盤組織，無論在細(xì)胞總的存活率及PG含量上均優(yōu)于-80℃，1年的液氮保存期間，細(xì)胞存活率及功能蛋白PG含量均在一個(gè)恒定的

16、水平，能滿足異體椎間盤移植的基本要求，可作為組織工程椎間盤的支架材料。
　　2.利用pSNAV2.0質(zhì)粒包轉(zhuǎn)系統(tǒng)能成功將外源性基因hBMP7包裝成滴度及純度滿足實(shí)驗(yàn)要求的rAAV-hBMP7病毒載體。
　　3.rAAV2-hBMP7病毒載體能有效地轉(zhuǎn)染犬髓核細(xì)胞并長期穩(wěn)定表達(dá)人骨形成蛋白-7，并能提高犬髓核細(xì)胞蛋白多糖及Ⅱ型膠原含量，這將能為組織工程椎間盤提供可選擇的基因修飾的種子細(xì)胞。
　　4.利用液氮儲存異體椎間盤