椎間盤組織工程支架材料KLD-12自組裝多肽的構建及復合MSCs治療椎間盤退變的實驗研究.pdf

1、第一部分 KLD-12多肽自組裝及其生物相容性的實驗研究
　　 目的：合成帶有AcN-KLDLKLDLKLDL-CNH2片段的KLD-12多肽分子，研究其自組裝及生物相容性。
　　 方法： 多肽合成儀合成KLD-12自組裝多肽分子，高效液相色譜法及質譜法分析純化。中性PBS液觸發(fā)0.5％、0.25％、0.1％KLD-12多肽溶液自組裝，觀察自組裝凝膠外形。原子力顯微鏡（Atomic Force Microscope，AF

2、M）檢測多肽自組裝納米纖維。抽取兔新鮮骨髓，密度梯度法分離骨髓間充質干細胞（MesenchymAlStem Cells，MSCs），體外培養(yǎng)增殖，流式細胞儀檢測MSCs（P3）CD34、CD90、CD44和CD45抗原表達。完全培養(yǎng)基調整KLD-12多肽溶液濃度，最終濃度分別為0.01％、 0.03％、0.05％，完全培養(yǎng)基作為對照組，體外培養(yǎng)MSCs 24h、48h，MTT法檢測細胞生物活性。溶血試驗檢測KLD-12多肽溶液(0.01

3、％)溶血率。皮膚刺激試驗及皮膚植入試驗檢測KLD-12多肽凝膠對局部皮膚刺激反應。
　　 結果：KLD-12多肽純度為95.36％。相對分子量為1467.83。0.5％KLD-12多肽溶液在 PBS液觸發(fā)下，能快速自組裝成水凝膠，水凝膠均質透明，結構完整，表面有足夠的彈性維持凝膠外形。而0.1％和0.25％多肽溶液自組裝形成的凝膠結構不完整，只在局部形成凝膠顆粒。AFM顯示KLD-12多肽可自組裝成納米纖維，直徑10-30nm

4、(平均:13.7±4.7 nm)，纖維長度為數百納米，纖維相互交織形成多孔網狀結構。體外培養(yǎng)的MSCs貼壁生長，呈紡錘形及梭形，流式細胞術檢測細胞高表達CD90、CD44，不表達CD34和CD45。多肽溶液（0.01％、0.03％、0.05％）培養(yǎng)的MSCs貼壁生長良好，與對照組相比，試驗組24 h及48 h吸光度（A值）無統計學差異（P>0.05）。溶血試驗結果顯示，KLD-12多肽溶液的溶血率為0.112％。皮膚刺激試驗結果顯示，試

5、驗組皮膚無明顯腫脹、紅斑及焦痂形成，皮膚刺激試驗評分為0分。HE染色結果顯示，多肽溶液植入部位皮膚層次清晰，結構正常，無明顯中性粒細胞及淋巴細胞浸潤。
　　 結論：KLD-12多肽合成成功，能自組裝為結構完整的水凝膠及納米纖維。KLD-12自組裝多肽與MSCs和宿主具有良好生物相容性。
　　
　　 第二部分 KLD-12自組裝多肽與髓核細胞體外復合培養(yǎng)的試驗研究
　　 目的：KLD-12自組裝多肽復合髓

6、核細胞體外三維培養(yǎng)，檢測多肽凝膠內髓核細胞生物活性及細胞表型，探討KLD-12自組裝多肽作為椎間盤組織工程細胞支架材料的可行性。
　　 方法： KLD-12多肽復合髓核細胞（P1）體外三維培養(yǎng)二周。倒置顯微鏡觀察細胞在凝膠內分布。培養(yǎng)第1天、第3天、第7天、第14天，CCK-8法檢測髓核細胞增殖。培養(yǎng)第7天、第14天，鈣黃綠素（Calcein-AM）及碘化丙啶 （PI）熒光染色檢測凝膠內活細胞和死細胞，并計算活細胞比率。培養(yǎng)第1

7、4天，逆轉錄聚合酶鏈反應（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)檢測凝膠內髓核細胞II型膠原及Aggrecan mRNA表達。免疫熒光染色檢測凝膠內髓核細胞II膠原及I型膠原表達。收集第1、4、7、10、13天培養(yǎng)基，檢測培養(yǎng)基內GAG含量。
　　 結果：體外培養(yǎng)的髓核細胞貼壁生長，呈梭形及紡錘形。凝膠內髓核細胞分布均勻，呈圓形細胞形態(tài)，凝膠邊緣的髓核細胞呈

8、梭形及紡錘形。細胞增殖試驗結果顯示，凝膠/髓核細胞吸光度（A值）隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸增高。Calcein-AM/PI熒光染色顯示：培養(yǎng)第7天，凝膠內細胞生長良好，大量活細胞存在，維持圓形的細胞形態(tài)，凝膠邊緣細胞呈梭形及紡錘形，部分細胞出現增殖，呈現“啞鈴形”。與第7天相比，培養(yǎng)14天的髓核形態(tài)無明顯改變，細胞生長良好，但增殖的“啞鈴形”細胞稍有增多。細胞存活率顯示，第7天及第14天細胞存活率均為92.6％。RT-PCR結果顯示，凝膠

9、內髓核細胞表達II型膠原mRNA及Aggrecan mRNA。免疫熒光染色結果顯示，凝膠內大量髓核細胞表達II型膠原，細胞外基質II型膠原中度陽性染色，僅少量細胞表達I型膠原。GAG檢測結果顯示，試驗組培養(yǎng)基GAG含量隨著培養(yǎng)時間延長而呈非直線性增加。
　　 結論：KLD-12多肽凝膠能為髓核細胞生長及增殖提供良好的微環(huán)境。凝膠內髓核細胞表型穩(wěn)定，在基因及分子水平上功能正常。KLD-12自組裝多肽可作為良好的椎間盤組織工程細胞支

10、架材料。
　　
　　 第三部分 KLD-12自組裝多肽復合MSCs三維培養(yǎng)及原位植入多肽/MSCs治療椎間盤退變的實驗研究
　　 目的：KLD-12自組裝多肽復合MSCs培養(yǎng)2周，構建以KLD-12多肽為支架材料的椎間盤組織工程化移植物。將構建的組織工程化KLD-12多肽/MSCs原位植入退變椎間盤，探討KLD-12多肽/MSCs治療椎間盤退變效果。
　　 方法： 體外部分：KLD-12自組裝多肽復合M

11、SCs（P3）體外三維培養(yǎng)二周。倒置顯微鏡下觀察細胞分布。培養(yǎng)第1天、第3天、第7天、第14天，檢測凝膠內MSCs生物活性。培養(yǎng)第7天、第14天，鈣黃綠素（Calcein-AM）及碘化丙啶 （PI）熒光染色檢測凝膠內活細胞和死細胞，并計算活細胞比率。體內部分：誘導兔椎間盤退變。將構建的組織工程化KLD-12多肽/MSCs原位植入退變椎間盤。術后12周，腰椎正側位X光片測量椎體高度及椎間盤高度，計算椎間盤高度指標DIH，％DIH表示術后椎

12、間盤高度變化（％DIH=術后DIH/術前DIH×100％）。腰椎MRI測量椎間盤T2加權相信號強度。大體觀察、HE染色觀察椎間盤退變程度并分級。甲苯胺藍染色法觀察髓核組織內蛋白多糖含量。逆轉錄聚合酶鏈反應（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)檢測椎間盤II型膠原及Aggrecan基因表達。Hochest標記MSCs與KLD-12多肽復合，原位植入兔椎間盤退變模型，

13、術后4周取出椎間盤標本，倒置熒光顯微鏡下觀察MSCs在椎間盤組織內的分布。結果 體外部分：倒置顯微鏡下觀察，凝膠內MSCs分布均勻，呈圓形細胞形態(tài)，凝膠邊緣細胞呈梭形。細胞增殖試驗結果顯示，凝膠/MSCs吸光度（A值）隨著培養(yǎng)時間延長而逐漸增高。Calcein-AM/PI熒光染色結果顯示：培養(yǎng)第7天，凝膠內大量活細胞存在，MSCs生長良好，細胞形態(tài)呈圓形，凝膠邊緣細胞呈梭形及紡錘形，部分細胞增殖，呈“啞鈴形”。培養(yǎng)至第14天，MSCs生

14、長良好，與第7天相比，MSCs形態(tài)無明顯改變，但增殖的“啞鈴形”細胞稍有增多。細胞存活率顯示，第7天細胞存活率為92.15％，第14天為91.81％，兩組相比，統計學差異無顯著性（P>0.05）。體內部分：移植的MSCs主要集中于髓核組織內，細胞分布基本均勻，少部分細胞向纖維環(huán)遷移。放射學檢查結果顯示：移植組椎間隙輕度狹窄，％ DHI為90.21％， 假移植組明顯狹窄，％ DHI為60.56％，兩組相比，差異具有顯著性（P<0.05）。

15、MRI結果顯示，與移植組MRI信號強度相比，假移植組信號強度明顯下降，兩組相比，差異具有統計學顯著性，（P<0.05）。大體觀察結果顯示，假移植組椎間盤結構明顯退變，髓核組織缺失。移植組纖維環(huán)結構基本正常，髓核組織再生，結構欠完整。組織學檢查結果顯示，假移植組纖維環(huán)層狀結構明顯紊亂，髓核組織及髓核細胞消失。移植組椎間盤組織結構基本正常，纖維環(huán)組織層狀結構稍有紊亂，可見再生髓核組織和髓核細胞。退變評級：移植組1～2級，假移植組4～5級。甲

16、苯胺藍染色結果顯示：移植組髓核組織甲苯胺藍中度染色，假移植組髓核缺失，內層纖維環(huán)組織淡染。RT-PCR結果顯示：三組椎間盤組織均表達II型膠原mRNA及Aggrecan mRNA。三組相比，II型膠原mRNA表達水平無統計學差異（P>0.05）。移植組Aggrecan mRNA表達與正常組相同，明顯高于假移植，差異具有統計學意義（P<0.05）。
　　 結論：KLD-12多肽凝膠為MSCs生長、增殖提供良好的微環(huán)境。組織工程化K