來源于人退變椎間盤的三種干細胞與BM-MSCs生物學特性及組織工程應用的比較研究.pdf

1、背景:
　　下腰痛(lowbackpain,LBP)是臨床常見疾病,是導致勞動力喪失的主要原因之一,現(xiàn)在一致認為椎間盤退變性疾病(Degenerativediscdisease,DDD)是引起LBP最常見的原因。有報道發(fā)現(xiàn)80％的人一生當中都曾發(fā)生過LBP,如此高的發(fā)病率給國家和社會帶來了嚴重的經(jīng)濟損失。
　　目前治療DDD的方法包括保守治療和手術治療。保守治療屬對癥治療,以減輕和緩解疼痛為目的,不能解決椎間盤(Interv

2、ertebraldisc,IVD)退變導致的生物學喪失問題,因此并不能從根本上解決疼痛的根源。手術治療主要包括髓核摘除術和脊柱融合術。手術治療旨在解除突出的椎間盤組織的機械壓迫作用,從而達到解除疼痛的目的,但其也因未能恢復IVD的生物學性能,遠期效果并不好,且常因內固定的使用而加速相鄰節(jié)段椎間盤退變,從而發(fā)生新的問題。
　　隨著科學技術的日新月異,特別是近年來逐漸出現(xiàn)了多種IVD移植和人工椎間盤置換技術,這些技術一定程序上改善了臨

3、床治療的效果,但這些技術也沒有從根本上解決或者逆轉IVD的生物學功能,仍然存在許多并發(fā)癥和缺陷?，F(xiàn)在認為理想的治療DDD的方法是既能緩解疼痛癥狀,又能恢復IVD的結構和生理功能,遠期效果好,復發(fā)率低。隨著基礎醫(yī)學特別是干細胞研究的迅速發(fā)展,基于干細胞的治療手段已成為治療DDD最有希望前途的手段之一。
　　近年來,應用組織工程技術對退變椎間盤進行再生和修復的研究取得了一些成績,尋求以提高所構建的組織工程椎間盤的生物學活性為目的的新型

4、種子細胞來源成為一項重要的任務。當前,多項研究證實人退變纖維環(huán)、髓核組織中存在具有多向分化潛能的干細胞。此外,在我們的前期工作中,課題組從人退變軟骨終板中亦分離出類似于MSC的干細胞,這些細胞經(jīng)誘導可以向骨、軟骨、脂、肌方向分化,且體外實驗結果顯示出比BM-MSCs更強的成軟骨能力。本研究旨在前期研究的基礎上,從人退變椎間盤中分離、擴增纖維環(huán)細胞、髓核細胞、軟骨終板細胞,經(jīng)瓊脂糖懸浮培養(yǎng)法篩選后,并探討纖維連接蛋白篩選的效能,所獲取的干

5、細胞克隆與來自同一個體的BM-MSCs進行初步的細胞生物學特性比較,作為種子細胞分別構建組織工程髓核,進一步比較上述四種干細胞在動物體內的髓核再生和椎間盤的修復能力。
　　目的:
　　通過體內、外實驗對NPSCs、AFSCs、CESCs與BM-MSCs的生物學特性進行檢測與比較,初步探討四種干細胞在細胞形態(tài)、增殖活性、表面標記物和體外向三系分化的能力以及作為組織工程種子細胞在組織工程應用上的生物學特性差異,以期尋找一種新的、

6、可應用于組織工程學的種子細胞,為組織工程椎間盤的構建甚至臨床的應用治療提供良好的種子細胞來源。
　　方法:
　　從因患腰椎間盤退變性疾病行椎間盤摘除植骨融合術中收集符合納入標準的標本。將手術中最先切除出來的AF組織經(jīng)副教授以上職稱經(jīng)驗豐富的術者確認后,收入AF標本盒,隨后兩次切除組織予以舍棄,其后切除的標本經(jīng)術者確認為NP時裝NP標本盒,刮除的CEP裝入CEP盒,植骨前取髂骨時接>5ml骨髓,以上標本再在解剖顯微鏡下清理異物

7、雜質如韌帶、肌肉及脂肪等,再次分離AF、NP及CEP,運用機械-酶消化法獲取AF細胞、NP細胞和CEP細胞。BM-MSCs運用Percoll液梯度分離法獲取。獲得的IVD來源的三種細胞經(jīng)體外擴增至第2代時,第2代細胞經(jīng)瓊脂糖懸浮培養(yǎng)法篩選,并初步探討Fibonectin差別粘附法的篩選效果,挑選取單細胞形成的克隆進行體外擴增,擴增后的細胞進行流式細胞術檢測干細胞標志物、多向分化能力,進行干細胞的鑒定。同樣,經(jīng)誘導向骨、軟骨及脂三系分化的

8、不同干細胞,經(jīng)RT-PCR及組織學檢測分析,尋找不同干細胞向不同細胞系分化能力的差異性。將不同干細胞復合藻酸鹽體外構建組織工程髓核,培養(yǎng)1、7、14及28天后進行支架細胞增殖檢測、DNA和sGAG含量檢測,最后行SEM檢測,尋找差異性。另外所獲細胞經(jīng)CFDA-SE熒光染料標記后植入纖維環(huán)穿刺抽髓核抽吸法制造的椎間盤退變動物模型體內,于術后第1、3及6月后進行MRI和X線檢測評估IVD的退變情況,并在第6月處死動物,進行目標椎間盤的組織學

9、檢測評估。鑒于在前兩部分實驗中,發(fā)現(xiàn)四種不同干細胞中,CESCs具有最強的體外成骨及成軟骨能力,復合藻酸鹽構建的組織工程髓核也具有良好的生物學性能。此外,已有大量研究發(fā)現(xiàn)BM-MSCs具有良好的體內成骨效應,常常作為種子細胞來探討用于橫突間植骨融合的應用研究,并顯示出了良好的應用前景。因此,我們特將CESCs與BM-MSCs一起復合多孔羥基磷灰石植入新西蘭大白兔兩側橫突間,術后2月時間內進行X線、三維CT及microCT檢測及組織學評估

10、,探討兩種不同干細胞間的成骨效應差異,分析和評估橫突間融合的融合效率差異。數(shù)據(jù)應用SPSS13.0軟件作統(tǒng)計學處理,定量結果采用配對T檢驗、單因素方差分析和重復測量的單因素方差分析進行統(tǒng)計分析,P<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1.來自同一個體的AFSCs、NPSCs、CESCs與BM-MSCs形態(tài)上類似,呈成纖維細胞樣外觀,但仍存在細小差別,AFSCs最細長,BM-MSCs最寬大,而CESCs尺寸最短,N

11、P居中;四種干/祖的體外增殖能力沒有顯著差異;在體外實驗觀察中,經(jīng)PCR及半定量分析,CESCs成骨和成軟骨能力最強,AFSCs和BM-MSCs居中,兩者沒有顯著差異,而NPSCs最弱;BM-MSCs成脂能力最強,NPSCs次之,CESCs和AFSCs最弱;流式細胞術結果表明,AFSCs和CESCs的CD105表面標志物均值呈中強表達,低于95%,而NPSCs略低于95%,四組干細胞的其它標志物的表達,滿足ISCT對間充質干細胞的定義標

12、準;四種干細胞體外構建的組織工程髓核培養(yǎng)結果表明,CESCs與BM-MSCs組中合成和分泌的sGAG與DNA含量最高,NPSCs次之,AFSCs最弱;組織工程髓核中的細胞增殖無顯著差異;組織工程髓核的SEM結果表明,各干細胞皆與支架粘附較好,在28天后能分泌大量的ECM,其中CESCs最多,BM-MSCs次之,NPSCs居中,AFSCs最弱。
　　2.AFSCs、NPSCs、CESCs與BM-MSCs復合藻酸鹽植入椎間盤退變的動物

13、模型體內,通過術后的檢測分析,CESCs-藻酸鹽復合物相對其余三組細胞具有最強的髓核再生和椎間盤修復能力,BM-MSCs-藻酸鹽和NPSCs-藻酸鹽居中,而AFSCs-藻酸鹽最弱。
　　3.CESCs與BM-MSCs與HA復合進行兔腰椎橫突間植骨對比中,兩組干細胞復合HA皆能達到橫突融合,增強脊柱的穩(wěn)定性;CESCs相對BM-MSCs具有更強的體內成骨能力;多孔羥基磷灰石在應用于腰椎橫突間植骨融合實驗時,抗折性較差,需要加以改進,

14、以適應一定的抗折性要求。
　　結論:
　　1.體外比較實驗中,CESCs具有最強的成骨和成軟骨能力,AF和BM-MSCs居中,NPSC最弱。
　　2.CESCs顯示了用于構建組織工程髓核的優(yōu)秀的生物學特性,在體內或體外都可以作為一種具有優(yōu)越性能的種子細胞應用于髓核組織工程領域,發(fā)揮干細胞的潛能。
　　3.初步實驗結果表明相比較BM-MSCs,CESCs具有更強的體內成骨能力。此外,CESCs能夠作為一種優(yōu)秀的種子