來源于茶擬盤多毛孢的一個(gè)新金色病毒的鑒定及生物學(xué)特性的研究.pdf

1、茶輪斑病是危害茶樹[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze]生產(chǎn)的重要病害，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致葉片大量脫落，影響茶葉品質(zhì)和產(chǎn)量，目前在我國茶園中廣泛發(fā)生。茶擬盤多毛孢（Pestalotiopsis theae）是引起茶輪斑病的優(yōu)勢種。我們前期在田間分離獲得了一株致病力喪失的茶擬盤多毛孢菌株LI-41，其較正常菌株表現(xiàn)出菌落形態(tài)異常，菌絲生長速度緩慢。本研究是針對菌株LI-41生物學(xué)性狀發(fā)生變化的原因進(jìn)行了探索，所得結(jié)果如下

2、:
　　對菌株LI-41和正常菌株(TP-2-2W)的菌絲進(jìn)行雙鏈RNA(double stranded RNA，dsRNA)的提取，發(fā)現(xiàn)LI-41菌株中含有4條dsRNA片段（dsRNA1-4），隨機(jī)克隆以及末端克隆測序顯示，其大小分別為3387、2831、2599和932nt，分析推測每一條dsRNA分別編碼一個(gè)獨(dú)立的開放閱讀框(Open-Reading Frame，ORF)，依次命名為ORF1、ORF2、ORF3和ORF4。

3、將獲得的4條dsRNA序列編碼蛋白采用BLASTp與登錄在NCBI中的序列比對，顯示該病毒ORF1-3編碼蛋白與金色病毒屬的膠孢炭疽菌金色病毒-1（Colletotrichum gloeosprioides chrysovirus1，CgCV-1）編碼蛋白相似性最高，相似率分別為65％、48％和54％，而ORF4編碼蛋白未搜到任何病毒的同源序列，我們將其命名為茶擬盤多毛孢金色病毒-1(Pestalotiopsis theae chrys

4、ovirus1，PtCV-1)。根據(jù)與已知蛋白的相似性推測，PtCV-1的ORF1編碼依賴RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNApolymerase，RdRp)，ORF2編碼外殼蛋白(Coat protein，CP)，ORF3編碼甲基轉(zhuǎn)移酶，ORF4所編碼的蛋白功能未知。
　　采用蔗糖梯度超速離心法提純PtCV-1的病毒粒體，分別從蔗糖各梯度層的病毒粒子提取核酸，結(jié)果顯示在20％-50％蔗糖層均存在4條核酸鏈，大

5、小與從菌絲中提取的4條dsRNA大小一致，其中50％蔗糖層中病毒含量最高。將50％蔗糖層純化的病毒粒子進(jìn)行銅網(wǎng)吸附后負(fù)染，經(jīng)透射電鏡觀察，觀察到了球形病毒粒子，其直徑為30.1～39.8nm。
　　將LI-41誘導(dǎo)產(chǎn)孢，挑選42個(gè)分生孢子培養(yǎng)后，進(jìn)行PtCV-1的dsRN檢測，結(jié)果顯示67％分生孢子再生后代仍含有PtCV-1。將LI-41與分生孢子再生無毒菌株（LI-41-1）對峙培養(yǎng)，在LI-41-1菌落邊緣挑取50個(gè)菌絲塊進(jìn)行

6、dsRNA檢測，結(jié)果顯示有6個(gè)傳毒后代檢測結(jié)果呈陽性，表明PtCV-1可以水平傳毒給遺傳背景相同的菌株。用PEG介導(dǎo)病毒粒子和核酸轉(zhuǎn)染單孢無毒后代菌株（LI-41-1）的原生質(zhì)體，然后對轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體的后代菌株進(jìn)行培養(yǎng)，分別篩選150個(gè)原生質(zhì)體再生后代菌株進(jìn)行dsRNA檢測，結(jié)果顯示，僅有5個(gè)病毒粒子轉(zhuǎn)染后代菌株檢測到了PtCV-1的dsRNA條帶。由此推測，該病毒的核酸可能不具有侵染性，但可以通過病毒粒子和水平傳毒的方式傳染給無毒的分生

7、孢子后代菌株中。
　　比較分生孢子后代無毒菌株(LI-41-1、LI-41-2、LI-41-3)、原始帶毒菌株（LI-41）、分生孢子后代帶毒菌株（LI-41-V1、LI-41-V2）、病毒粒子傳毒后代菌株(LI-41-1T1、LI-41-1T2、LI-41-1T3)和對峙培養(yǎng)傳毒后代菌株(LI-41-1P-1、LI-41-1P-2、LI-41-1P-3)生物學(xué)性狀表明，帶毒菌株和無毒菌株菌落形態(tài)和致病力表現(xiàn)顯著差異:帶毒菌株較無

8、毒菌株均色素增多，菌絲輪紋圈消失;菌落畸形;生長速度降低，正常菌株為6.5-6.7mm/d，帶毒菌株為2.0-2.8mm/d;致病力減弱，在來源于云南和廣西本地種茶葉上,無毒菌株接種引起的病斑大小分別為11.9-14.1mm和17.5-21.5mm，而帶毒菌株沒有引起明顯的病斑。以上結(jié)果表明:PtCV-1侵染茶擬盤多毛孢可引起其菌絲畸形，生長速度減弱和致病力顯著降低。
　　本研究報(bào)道了侵染茶擬盤多毛孢的金色病毒屬新成員PtCV-1