來源于蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中產(chǎn)抑菌素乳酸菌的分離、鑒定、特性研究.pdf

1、乳酸菌可以產(chǎn)生各類抑菌物質(zhì)，如酸類物質(zhì)乳酸和乙酸、過氧化氫、抑菌素等。抑菌素是一類由乳酸菌分泌產(chǎn)生有抑菌作用的蛋白類物質(zhì)。來源于乳酸菌的抑菌素可作為生物防腐劑應用到食品中，因為乳酸菌通常被作為發(fā)酵食品的發(fā)酵劑，并且被認為是對人安全的GRAS食品添加劑。抑菌素和抗生素最大的不同是抑菌素嚴格作用于相關的特定微生物或者是和產(chǎn)抑菌素菌類相近的微生物類群。另一方面，抗生素有更廣泛的抑菌譜，且對親緣關系近的菌株沒有選擇性。另外，抑菌素是核糖體合成的

2、初級或次級代謝產(chǎn)物，而抗生素通常是初級代謝產(chǎn)物。對于蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中產(chǎn)抑菌素乳酸菌的研究還很少。因此，本研究的目的是從蒙古不同地區(qū)的發(fā)酵乳制品中分離篩選出產(chǎn)抑菌素的乳酸菌，研究不同營養(yǎng)物質(zhì)的產(chǎn)抑菌素效果的影響，優(yōu)化培養(yǎng)條件，評價抑菌素對食品腐敗菌Listeria monocytogenes和Enterococcus faecalis的抑制作用。在研究中，對乳酸菌的初篩使用含有5％(w/v)CaCO3和0.02%(w/v)溴甲酚紫的改

3、良MRS培養(yǎng)基，對乳酸菌的鑒定采用16 S rRNA基因序列分析的方法，并使用牛津杯法抑菌試驗篩選抑菌素生成菌株及測定抑菌素活力。通過pH、溫度和酶的作用等因素對抑菌素活力的影響研究抑菌素的特性。研究在極端條件下，如低pH、高膽鹽等的耐受程度，產(chǎn)抑菌素活力的變化情況來表明其作為益生菌的特性。使用Plackett-Burman實驗設計來優(yōu)化產(chǎn)抑菌素條件，確定對產(chǎn)抑菌素最重要的影響因素，通過響應面分析建立模型，評價主要的影響因子，確定有顯著

4、性的影響因子，選擇出產(chǎn)抑菌素的最優(yōu)條件。本研究的主要結果如下所示：
　　1、來源于蒙古傳統(tǒng)乳制品中產(chǎn)抑菌素乳酸菌的分離、篩選與鑒定
　　使用含有5%(w/v) CaCO3和0.02%(w/v)溴甲酚紫的改良MRS培養(yǎng)基對來自蒙古傳統(tǒng)乳制品的10種樣品進行乳酸菌的分離，通過培養(yǎng)基顏色改變、過氧化氫酶作用和溶鈣圈的形成，確定其中六種樣品含有乳酸菌。從六種樣品中，挑選、純化出125株革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性菌株。觀察單菌株的形態(tài)

5、特征，大部分菌株球菌（8株分離自MG2，9株分離自MG6，13株分離MG7，48株分離自MG8，40株分離自MG9，4株分離自MG10），剩下的是桿菌（3株分離自MG6.1）。因此，使用這125株菌進行抑菌素的初篩。結果表明，30株菌具有抑制E.faeacalis VTM2R和L. monocytogenes ATCC19114的活性。同時測定了菌株的無細胞上清液的抑菌效果。在30株菌中，只有MG2-8、MG6-1和MG10-2的無細胞

6、上清液表現(xiàn)出對E.faecalis VTM2R和L. monocytogenes ATCC19114的抑制作用。通過16S rRNA序列分析鑒定這三株菌為Enterococcus durans(MG2-8)，Enterococcus faecium(MG6-1),和Enterococcus durans(MG10-2)。MG2-8的無細胞上清液表現(xiàn)出對E. faecalis和L. monocytogenes最高的抑菌效果，因而選擇Ent

7、erococcus durans MG2-8，進一步研究其產(chǎn)抑菌素的特性，并優(yōu)化其產(chǎn)抑菌素的培養(yǎng)條件。指示菌E.faeacalis VTM2R和L.monocytogenes ATCC19114屬抑菌素敏感菌株。因此，在這項研究中選擇這兩株菌作為指示菌。在研究中還測定了E.durans MG2-8生長及產(chǎn)抑菌素情況，結果顯示，在培養(yǎng)3h后，進入對數(shù)期，細胞密度從0.3增長到對數(shù)期末的1.44。在培養(yǎng)2h后當抑菌素活力為60 AU/ml，

8、表現(xiàn)出對E.faecalis VTM2R的抑制作用，當培養(yǎng)到30h，在穩(wěn)定期內(nèi)，抑菌素的活力達到最大值為480 AU/ml。
　　2、產(chǎn)抑菌素菌株Enterococcus durans MG2-8的抑菌素特性及益生菌特性
　　酶類對MG2-8產(chǎn)抑菌素的影響作用顯示，當加入蛋白分解酶如蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白時，抑菌效果明顯減弱，而使用非蛋白分解酶如纖維素酶、溶壁酶作用時，不影響抑菌效果，這表明MG2-8的抑菌作用是因為其產(chǎn)

9、生的蛋白類物質(zhì)。無細胞上清液（活力為60 AU/ml）在100℃120 min條件，抑菌活力沒有明顯損失，然而121℃5 min則抑菌活力完全失去。對抑菌素對產(chǎn)生菌細胞的吸附的研究表明，該抑菌素對產(chǎn)生菌的細胞沒有吸附作用。100 AU/ml活力的抑菌素對培養(yǎng)2 h的指示菌抑制結果表明，在前10 h能完全抑制指示菌的長，L.monocytogenes ATCC9114和E. faecalis VTM2R兩種菌液濃度僅各自分別從0.07到0

10、.08和0.12到0.19(OD600)，到14 h時指示菌開始快速增長，22 h達到對照的標準。細菌素MG2-8通過Tricine-SDS-PAGE測定分子量，染色的一半膠中觀察到有兩條蛋白質(zhì)條帶，對照另一半覆蓋有糞腸球菌VTM2R的BSM軟瓊脂的膠的抑菌圈的位置，可知細菌素MG2-8的分子量大約為5.8kDa，通過分子量的大小確定了細菌素MG2-8屬于II類細菌素。培養(yǎng)條件中NaCl、pH和膽鹽濃度對E. durans MG2-8生

11、長的影響表明，該菌可以在9%NaCl的條件下生長，對膽鹽耐受性的濃度為0.3%，對pH的耐受范圍在2-12之間。
　　3、MG2-8產(chǎn)抑菌素條件優(yōu)化
　　Plackett-Burman design試驗結果表明在經(jīng)過24 h培養(yǎng)后24種影響因子下的抑菌素活力在60~960 AU/ml的范圍內(nèi)。通過顯著性分析，胰蛋白胨、脫脂奶粉和葡萄糖的置信度分別達到95.9%、99.4%和99.6%（p-值<0.05)。然后通過響應面分析法

12、確定顯著的影響因子進行評價。使用中心合成設計（CCD）的結果表明，在20種設計中抑菌素的活力在360~960AU/ml的范圍內(nèi)。該模型計算的樣本可決系數(shù)R2為0.84，這和修正決定系數(shù)值很接近，說明得到的二次模型方程有較高的擬合度。響應面分析得到的優(yōu)化結果和二次模型方程預測的結果很接近。最佳的產(chǎn)抑菌素的條件為胰蛋白胨17.93(g/l)、脫脂奶粉2.06(g/l)和葡萄糖10.62(g/l)，響應面模型預測的產(chǎn)抑菌素活力為972.78

13、AU/ml。通過進一步的重復驗證試驗得到該條件下的產(chǎn)抑菌素活力為960 AU/ml和預測的結果較為一致。通過響應面法對產(chǎn)抑菌素菌株培養(yǎng)基成分的優(yōu)化，產(chǎn)抑菌素活力從480 AU/ml增長到960 AU/ml。上述實驗表明，可以通過Plackett-Burman design和響應面分析法（RSM）在對Enterococcus durans MG2-8產(chǎn)抑菌素的培養(yǎng)基成分的優(yōu)化以提高產(chǎn)抑菌素活力。實驗結果也確認了該實驗設計及數(shù)據(jù)分析的可信度