斑污擬盤多毛孢菌激活蛋白的分離純化及其生物活性的研究.pdf

1、激活蛋白(Activator protein)是從多種病原真菌中分離的具有誘導(dǎo)植物抗病性、增強(qiáng)抗逆能力、促進(jìn)植物生長(zhǎng)等生物活性的一類新型蛋白激發(fā)子。激活蛋白能顯著增強(qiáng)植株對(duì)多種重要植物病原體的系統(tǒng)廣譜抗性，且其誘抗效力強(qiáng)。目前對(duì)斑污擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsis maculans(Cda.) Nag Raj）菌絲體內(nèi)胞內(nèi)可溶性激活蛋白的研究尚未見報(bào)道。本研究以斑污擬盤多毛孢菌為實(shí)驗(yàn)材料，通過硫酸銨分級(jí)分段沉淀結(jié)合凝膠過濾層析

2、，從斑污擬盤多毛孢菌菌絲體中分離純化獲得分子量17.7kDa有激活生物活性的蛋白。生物活性測(cè)定表明，該蛋白可顯著提高玉米、白菜、黃瓜、豌豆種子的發(fā)芽率和根長(zhǎng)生長(zhǎng)，并可促進(jìn)豌豆、玉米幼苗植株生長(zhǎng)，提高豌豆、玉米幼苗葉片葉綠素含量，提高豌豆、玉米幼苗的根冠比和根系活力。本研究獲得了以下研究成果:
　　1.通過用濾液和蛋白粗提液處理玉米、白菜、黃瓜、豌豆種子，發(fā)現(xiàn)斑污擬盤多毛孢菌能夠產(chǎn)生可以促進(jìn)一些種子萌發(fā)和根長(zhǎng)生長(zhǎng)的有激活生物活性的成

3、分，并且此激活成分存在于蛋白粗提液中。本研究采用硫酸銨分級(jí)沉淀法對(duì)蛋白粗提液進(jìn)行鹽析，然后對(duì)硫酸銨沉淀所得上清液和沉淀進(jìn)行生測(cè)，生測(cè)結(jié)果顯示上清液沒有活性，沉淀有活性，證明活性物質(zhì)存在于沉淀中，說明有激活活性的物質(zhì)可能屬于大分子類蛋白質(zhì)，可能是斑污擬盤多毛孢菌菌絲體組成組分的胞內(nèi)可溶性蛋白，從而為進(jìn)一步分離純化奠定基礎(chǔ)。
　　2.由實(shí)驗(yàn)可知激活蛋白存在于斑污擬盤多毛孢菌菌絲體內(nèi)，為了在最短的時(shí)間內(nèi)盡可能地獲取最多的菌絲，本研究從接

4、種量、培養(yǎng)時(shí)間、溫度、溶氧量、搖床轉(zhuǎn)速、pH六個(gè)因素對(duì)斑污擬盤多毛孢菌在振蕩培養(yǎng)條件下產(chǎn)菌絲量進(jìn)行優(yōu)化選擇。以上六個(gè)培養(yǎng)條件分別達(dá)到最優(yōu)，組合起來即為最佳振蕩培養(yǎng)條件。實(shí)驗(yàn)得到溫度25℃，pH為6，三個(gè)菌餅接種到200mL培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng)11d，這樣的培養(yǎng)方案菌絲產(chǎn)量最大且最經(jīng)濟(jì)。
　　3.采用硫酸銨分級(jí)分段沉淀法對(duì)斑污擬盤多毛孢菌蛋白粗提液進(jìn)行鹽析，得到其鹽析的最適飽和度為60％。此粗提物經(jīng)Sephadex G-75凝膠細(xì)柱子層析

5、后得到兩個(gè)峰，其中峰2為活性峰。將峰2集中收集濃縮再過Sephadex G-75凝膠粗柱子層析后獲得7個(gè)峰，其中峰2-7經(jīng)檢測(cè)有活性，SDS-PAGE電泳檢測(cè)該峰為單一條帶，以相對(duì)遷移率(mR)算得該蛋白的分子量為17.7kDa。
　　4.研究純化蛋白的生物活性，研究其處理種子后對(duì)豌豆、玉米的發(fā)芽率，根長(zhǎng)生長(zhǎng)，植株生長(zhǎng)，葉綠素含量，根冠比，根系活力的影響。斑污擬盤多毛孢菌激活蛋白純化樣品處理豌豆、玉米種子后使豌豆、玉米種子的發(fā)芽率