交鏈孢菌激活蛋白抗體制備及免疫檢測.pdf

1、從真菌中提取的植物激活蛋白是一類熱穩(wěn)定蛋白，具有誘導植物抗性和促進植物生長的作用。本研究進行了交鏈孢菌(Alternaria.sp.)激活蛋白(簡稱ActP)的雙向電泳鑒定、抗體制備，通過篩選cDNA表達文庫，獲得ActP蛋白基因，純化了該基因的表達蛋白，為深入研究激活蛋白結構和作用機理奠定了基礎。 首次進行了交鏈孢菌激活蛋白的雙向分離。通過比較不同蛋白提取緩沖液，選用2mMEDTA溶液成功提取交鏈孢菌激活蛋白；對此蛋白進行等電

2、聚焦和雙向電泳，確定其pI為4。 特異性ActP35抗體的制備。電泳分離獲得分子量為35kD交鏈孢菌激活蛋白(簡稱ActP35)，以此為抗原免疫動物，制備兔多抗血清。本研究對斑點固相親和純化方法進行了改進，消除抗體和大腸桿菌之間的交叉反應，成功制備了大量高特異性ActP35抗體。 利用獲得的抗體免疫篩選交鏈孢菌cDNA表達文庫。用純化的ActP35蛋白抗體，從交鏈孢菌菌cDNA表達文庫中篩選獲得9個陽性克隆，測序結果與激

3、活蛋白ActP35質(zhì)譜鑒定肽段序列比較，獲得一個相似性較高的克隆。將此克隆所含基因(簡稱actd-2)進行表達，利用鰲合有鎳離子的親和層析柱成功分離、純化表達蛋白。 首次利用抗體免疫雜交技術研究交鏈菌激活蛋白和植物蛋白的互作蛋白。用FarWestern、抗體親和純化的方法研究發(fā)現(xiàn)，證明ActP35蛋白的抗體能夠特異性識別擬南芥中1，5-二磷酸核酮糖羧化氧化酶，表明兩蛋白可能有相同或相似的氨基酸序列。為激活蛋白作用機理研究提供證據(jù)