TGF-β3基因轉(zhuǎn)染MSCs復(fù)合殼聚糖的組織工程支架構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分:轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子β3(TGF-β3)基因重組腺病毒載體的構(gòu)建
　　 目的:將含轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子β3(Transforming Growth Factorbeta3,TGF-β3)基因的質(zhì)?？寺≈料俨《举|(zhì)粒載體中并導(dǎo)入包裝細(xì)胞,產(chǎn)生表達(dá)目的基因的重組腺病毒。
　　 方法:含有TGF-β3的質(zhì)粒經(jīng)酶切、分離、純化并采用定向克隆的方法克隆進(jìn)入穿梭質(zhì)pShuttle-EGFP中,獲得pShuttle-EGFP-TGFβ

2、3,與pAdxsi(腺病毒骨架質(zhì)粒)轉(zhuǎn)入細(xì)菌,得到TGF-β3重組腺病毒質(zhì)粒,用脂質(zhì)體介導(dǎo)入HEK293細(xì)胞,產(chǎn)生表達(dá)目的基因的重組腺病毒載體,用倍比稀釋方法測(cè)定重組腺病毒載體滴度。
　　 結(jié)果:(1)TGF-β3基因克隆進(jìn)入腺病毒質(zhì)粒載體中形成重組腺病毒質(zhì)粒pAdxsi-EGFP-TGFβ3;(2)重組腺病毒質(zhì)粒pAdxsi-EGFP-TGFβ3導(dǎo)入包裝細(xì)胞HEK293中形成能表達(dá)TGF-β3的重組腺病毒Ad-TGF-β3;(

3、3)倍比稀釋法測(cè)定獲得具有高滴度重組腺病毒Ad-TGF-β3。
　　 結(jié)論:TGF-β3基因克隆至重組腺病毒中,成功構(gòu)建TGF-β3基因重組腺病毒載體,為進(jìn)一步研究TGF-β3基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合殼聚糖支架打下了良好的基礎(chǔ)。
　　 第二部分 TGF-β3基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)復(fù)合至殼聚糖支架的研究
　　 目的:(1)探討殼聚糖支架的制備方法。(2)將目的基因TGF-β3轉(zhuǎn)染骨髓間充

4、質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)復(fù)合至殼聚糖支架觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況及目的基因的表達(dá)。
　　 方法:(1)利用冷凍干燥法制備殼聚糖支架。(2)密度梯度+貼壁法分離培養(yǎng)MSCs,將TGF-β3轉(zhuǎn)染MSCs熒光顯微鏡觀察TGF-β3轉(zhuǎn)染MSCs情況Western-Blot檢測(cè)TGF-β3基因轉(zhuǎn)染MSCs的蛋白表達(dá)情況。(3)TGF-β3轉(zhuǎn)染MSCs復(fù)合至殼聚糖支架,分別用MTT法和掃描電鏡法觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)粘附情況。
　　 結(jié)果:(1)2％

5、(w/w)的殼聚糖溶液使用冷凍干燥法制得白色海綿狀殼聚糖支架。(2)分離培養(yǎng)的MSCs純度高,形態(tài)均勻,TGF-β3轉(zhuǎn)染MSCs轉(zhuǎn)染效率高,Ad-TGF-β3轉(zhuǎn)染MSCs后對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖無影響,Western-Blot可見轉(zhuǎn)染TGF-β3的MSCs有陽(yáng)性條帶出現(xiàn)。(3)Ad-TGF-β3轉(zhuǎn)染MSCs復(fù)合至殼聚糖支架MSCs細(xì)胞生長(zhǎng)粘附良好,Ad-TGF-β3轉(zhuǎn)染MSCs對(duì)細(xì)胞在殼聚糖支架上的生長(zhǎng)增殖無影響,Ad-TGF-β3轉(zhuǎn)染MSCs