TGF-β3基因轉染MSCs復合殼聚糖的組織工程支架構建的實驗研究.pdf

1、第一部分:轉化細胞生長因子β3(TGF-β3)基因重組腺病毒載體的構建
　　 目的:將含轉化細胞生長因子β3(Transforming Growth Factorbeta3,TGF-β3)基因的質?？寺≈料俨《举|粒載體中并導入包裝細胞,產生表達目的基因的重組腺病毒。
　　 方法:含有TGF-β3的質粒經(jīng)酶切、分離、純化并采用定向克隆的方法克隆進入穿梭質pShuttle-EGFP中,獲得pShuttle-EGFP-TGFβ

2、3,與pAdxsi(腺病毒骨架質粒)轉入細菌,得到TGF-β3重組腺病毒質粒,用脂質體介導入HEK293細胞,產生表達目的基因的重組腺病毒載體,用倍比稀釋方法測定重組腺病毒載體滴度。
　　 結果:(1)TGF-β3基因克隆進入腺病毒質粒載體中形成重組腺病毒質粒pAdxsi-EGFP-TGFβ3;(2)重組腺病毒質粒pAdxsi-EGFP-TGFβ3導入包裝細胞HEK293中形成能表達TGF-β3的重組腺病毒Ad-TGF-β3;(

3、3)倍比稀釋法測定獲得具有高滴度重組腺病毒Ad-TGF-β3。
　　 結論:TGF-β3基因克隆至重組腺病毒中,成功構建TGF-β3基因重組腺病毒載體,為進一步研究TGF-β3基因轉染骨髓間充質干細胞復合殼聚糖支架打下了良好的基礎。
　　 第二部分 TGF-β3基因重組腺病毒轉染骨髓間充質干細胞(MSCs)復合至殼聚糖支架的研究
　　 目的:(1)探討殼聚糖支架的制備方法。(2)將目的基因TGF-β3轉染骨髓間充

4、質干細胞(MSCs)復合至殼聚糖支架觀察細胞的生長情況及目的基因的表達。
　　 方法:(1)利用冷凍干燥法制備殼聚糖支架。(2)密度梯度+貼壁法分離培養(yǎng)MSCs,將TGF-β3轉染MSCs熒光顯微鏡觀察TGF-β3轉染MSCs情況Western-Blot檢測TGF-β3基因轉染MSCs的蛋白表達情況。(3)TGF-β3轉染MSCs復合至殼聚糖支架,分別用MTT法和掃描電鏡法觀察細胞的生長粘附情況。
　　 結果:(1)2％

5、(w/w)的殼聚糖溶液使用冷凍干燥法制得白色海綿狀殼聚糖支架。(2)分離培養(yǎng)的MSCs純度高,形態(tài)均勻,TGF-β3轉染MSCs轉染效率高,Ad-TGF-β3轉染MSCs后對細胞生長增殖無影響,Western-Blot可見轉染TGF-β3的MSCs有陽性條帶出現(xiàn)。(3)Ad-TGF-β3轉染MSCs復合至殼聚糖支架MSCs細胞生長粘附良好,Ad-TGF-β3轉染MSCs對細胞在殼聚糖支架上的生長增殖無影響,Ad-TGF-β3轉染MSCs