TGF-β3和BMP-7基因共轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建組織工程髓核的相關(guān)研究.pdf

1、研究目的：利用TGF-β3和BMP-7共轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)并誘導(dǎo)其分化，以富血小板凝膠(PRG)為支架，構(gòu)建可局部注射的組織工程髓核。
　　 研究方法：以全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)兔BMSCs，通過細(xì)胞表面標(biāo)記物檢測及中胚層細(xì)胞誘導(dǎo)分化，確定其為BMSCs。
　　 人工合成TGF-β3和BMP-7基因片段，并行基因測序確定序列。以pDC316-MCMV-EGFP為載體質(zhì)粒，PPE3為骨架質(zhì)粒，構(gòu)建TGF-β3

2、腺病毒（TGFβ3-pDC316-MCMV-EGFP）和BMP-7腺病毒(BMP7-pDC316-MCMV-EGFP)，通過Realtime PCR檢測腺病毒中TGF-β3和BMP-7基因mRNA的表達(dá)。
　　 將培養(yǎng)的兔BMSCs傳代后，分成五組，分別為:A.空白對(duì)照組;B.GFP免疫熒光對(duì)照組;C.TGF-β3基因單獨(dú)轉(zhuǎn)染組;D.BMP-7基因單獨(dú)轉(zhuǎn)染組;E.TGF-β3和BMP-7基因共轉(zhuǎn)染組;以普通DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)14

3、天后，以Western blot方法檢測A、C、D、E組TGF-β3和BMP-7蛋白的表達(dá)情況。以Realtime PCR測定各組細(xì)胞的ACAN、CollagenⅠ、CollagenⅡ、CollagenX、SOX9基因的mRNA表達(dá)水平。
　　 以Lendersberg二次離心法制備PRP，與激活劑以10∶1比例混合激活后，以3000rpm離心10min獲得富生長因子上清，檢測其中TGF-β1和PDGF-AB生長因子的濃度，再將

4、PRP分別與兔BMSCs及TGF-β3和BMP-7基因共轉(zhuǎn)染的BMSCs分別混合，培養(yǎng)14天后，以掃描電鏡觀察共轉(zhuǎn)染組組織工程髓核結(jié)構(gòu)及細(xì)胞在富血小板凝膠支架中的生長情況。
　　 研究結(jié)果：以全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)獲得的細(xì)胞在特定誘導(dǎo)條件下具備向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞三種中胚層細(xì)胞分化的能力;流式細(xì)胞術(shù)檢測證實(shí)獲得的細(xì)胞存在CD29、CD105、CD166表面標(biāo)記物的表達(dá)。
　　 TGF-β3和BMP-7基因測序證

5、明合成基因序列正確無誤。以pDC316-MCMV-EGFP載體質(zhì)粒和PPE3骨架質(zhì)粒構(gòu)建的TGF-β3和BMP-7腺病毒擴(kuò)增后滴度分別為:1.495×1010 pfu/ml和1.185×1010pfu/ml。TGF-β3和BMP-7腺病毒DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后酶切電泳檢測顯示構(gòu)建腺病毒包含TGF-β3和BMP-7基因片段。
　　 以TGF-β3和BMP-7重組腺病毒轉(zhuǎn)染兔BMSCs后常規(guī)DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)14天，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯變

6、化，圓形及橢圓形細(xì)胞明顯增多。Western blot方法檢測TGF-β3和BMP-7蛋白表達(dá)水平明顯增高。培養(yǎng)14天時(shí)，Realtime PCR檢測ACAN、CollagenⅠ、CollagenⅡ、SOX9基因的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)，其中CollagenⅠ和SOX9單獨(dú)轉(zhuǎn)染組和共轉(zhuǎn)染組表達(dá)無明顯差異(P＞0.05)，CollagenⅡ共轉(zhuǎn)染組表達(dá)較單獨(dú)轉(zhuǎn)染組明顯增高(P＜0.05)。TGF-β3單獨(dú)轉(zhuǎn)染組和共轉(zhuǎn)染組

7、的Collagen X基因表達(dá)較BMP-7單獨(dú)轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組明顯降低(P＜0.05)。
　　 以Lenderberg法制備得PRP后，以激活劑激活獲得的富血小板凝膠支架中TGF-β1和PDGF-AB濃度分別為351.03±11.15 ng/ml和267.38±14.2 ng/ml，明顯高于兔全血中的濃度。掃描電鏡觀察結(jié)果示:凝膠內(nèi)部網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的孔隙直徑約在40μm至100μm之間，轉(zhuǎn)基因BMSCs較為均勻的分布于凝膠中，多數(shù)細(xì)胞伸

8、出大量指突到纖維骨架和凝膠孔隙之中。細(xì)胞在富血小板凝膠支架中生長良好。
　　 研究結(jié)論：通過全骨髓貼壁法可以成功分離獲得狀態(tài)良好的兔BMSCs。以pDC316-MCMV-EGFP為載體可成功構(gòu)建TGF-β3和BMP-7腺病毒，且其可轉(zhuǎn)染兔BMSCs，獲得TGF-β3和BMP-7蛋白的表達(dá)。TGF-β3和BMP-7腺病毒共轉(zhuǎn)染兔BMSCs后，ACAN、CollagenⅡ、SOX9基因表達(dá)均明顯升高，而Collagen X基因表達(dá)明