可注射式組織工程髓核移植治療椎間盤退變的實驗研究.pdf

1、目的: 證實可注射支架材料與種子細胞構建組織工程髓核能夠修復椎間盤缺損，阻止椎間盤進一步退變，修復已經(jīng)退變椎間盤，為退變性椎間盤疾病的治療開辟一條新的有效途徑。 方法: 1.種子細胞培養(yǎng)鑒定及篩選 1.1兔椎間盤髓核細胞的體外分離培養(yǎng)及鑒定 取健康2周齡新西蘭兔椎間盤髓核細胞，在含有15％滅活FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察原代和傳代細胞形態(tài)。分別在取材后、第1代、第2代

2、細胞培養(yǎng)期間，進行髓核細胞活力測定；爬片培養(yǎng)后進行甲苯胺藍、HE、聚集蛋白聚糖番紅O、I型膠原和II型膠原免疫組織化學染色，光鏡鏡下觀察；MTT法繪制髓核細胞生長曲線，并行透射電鏡觀察，對細胞體外的生物學特性進行研究。 1.2兔骨髓間充質干細胞的體外分離培養(yǎng)及鑒定 無菌條件下抽取健康幼年新西蘭兔脛骨骨髓2ml，經(jīng)密度梯度離心后獲取骨髓間充質干細胞，接種至100ml玻璃培養(yǎng)瓶中進行體外培養(yǎng)，觀察其細胞形態(tài)、貼壁率和超微結構

3、，流式細胞儀檢測細胞表面標記物及細胞生長周期，并進行成骨誘導反向證明，對細胞體外的生物學行為進行研究。 1.3比較上述兩種細胞優(yōu)缺點，篩選出最適合的種子細胞進行下一步實驗 2.可注射式組織工程髓核的構建及其生物學功能檢測 種子細胞與殼聚糖水凝膠復合形成可注射式組織工程髓核；細胞計數(shù)檢測細胞在凝膠中存活情況；組織工程髓核Ⅱ型膠原蛋白及蛋白聚糖免疫組化染色。 3.經(jīng)后路兔椎間盤髓核穿刺抽吸術建立椎間盤退變模型

4、 模擬人后路顯微內(nèi)窺鏡椎間盤摘除術，穿刺抽吸髓核，建立椎間盤退變模型。 4.可注射式組織工程髓核移植治療椎間盤退變 可注射式組織工程髓核注射移植入動物退變椎間盤內(nèi)，分別于術后4周、8周處死實驗動物，對相應椎間盤進行組織學及基因表達情況檢測。 結果: 1.種子細胞培養(yǎng)鑒定及篩選 1.1兔髓核細胞：1、倒置相差顯微鏡觀察見原代髓核細胞呈類圓形，折光較強，5d始有細胞貼壁，細胞呈多角形或短梭形，

5、6～8 d細胞生長進入指數(shù)期，約17 d時，細胞長滿瓶壁，可進行傳代，隨傳代次數(shù)增加，細胞形態(tài)逐漸由多角形、短梭形向長梭形改變；2、髓核細胞活力測定表明細胞在剛分離完成后活力約95％～97％，原代培養(yǎng)期間細胞活力為98％～100％，第1代培養(yǎng)期間細胞活力一般仍能維持為100％，第2代細胞活力下降較為明顯，約為75％～80％；3、髓核細胞甲苯胺藍染色呈強陽性，HE染色見細胞核、細胞質著色明顯，原代、第1代髓核細胞I型膠原蛋白免疫細胞化學染

6、色均呈陰性，II型膠原蛋白免疫細胞化學染色呈陽性，聚集蛋白聚糖番紅O染色呈陽性反應，而第2代髓核細胞I型膠原蛋白免疫細胞化學染色陽性，II型膠原蛋白免疫細胞化學染色呈弱陽性，聚集蛋白多糖番紅O染色著色較淺；4、MTT生長曲線與體外細胞培養(yǎng)時生長過程相符；5、細胞透射電鏡顯示原代髓核細胞內(nèi)線粒體少，細胞質內(nèi)有大量糖原顆粒，隨傳代次數(shù)增加，糖原顆粒減少，線粒體數(shù)量增多，細胞器開始腫脹。 1.2兔骨髓間充質干細胞：1、兔骨髓間充質干細

7、胞在體外培養(yǎng)2h后開始貼壁，20h后細胞基本貼壁完全，15d左右細胞融合達90％以上；2、透射電鏡觀察顯示分離培養(yǎng)的兔骨髓間充質干細胞細胞表面可見許多微絨毛，主要分布于胞體一側，胞核不規(guī)則，有切跡，細胞器豐富，具有典型未分化細胞特點；3、流式細胞儀檢測顯示分離培養(yǎng)的兔骨髓間充質干細胞表面標記物CD44、CD90表達呈陽性，CD45表達呈陰性，且絕大多數(shù)(約占細胞總數(shù)的97％)細胞的生長周期處于G1或G2期；4、成骨性誘導3周后，骨髓間充

8、質干細胞逐漸形成小的鈣鹽結晶體，細胞堿性磷酸酶染色呈陽性，Von Kossa染色顯示細胞聚集處存在大量鈣鹽，呈黑色沉積。 1.3篩選結果：骨髓間充質干細胞較髓核細胞取材方便，體外培養(yǎng)擴增容易，適合作為組織工程髓核的種子細胞。 2.可注射式組織工程髓核的構建及生物學功能檢測 骨髓間充質干細胞可以在殼聚糖水凝膠中生長增殖，并向類髓核細胞分化，II型膠原蛋白及蛋白聚糖免疫組化染色陽性。 3.經(jīng)后路兔椎間盤髓核穿

9、刺抽吸術建立椎間盤退變模型 3.1退變椎間盤HE染色觀察 退變4周的椎間盤可見髓核內(nèi)出現(xiàn)多個裂隙，髓核內(nèi)細胞顯示軟骨細胞化生，髓核與內(nèi)層纖維環(huán)交界處細胞可見核代償性增大，纖維環(huán)內(nèi)層纖維中度扭曲和裂隙形成，伴有內(nèi)層纖維環(huán)輕度向椎間盤凸入，按Nishimura標準分級為2-3級。退變8周后見髓核細胞基本消失，部分中央髓核區(qū)域缺如，可見較多形態(tài)類似成纖維細胞的細胞，纖維環(huán)纖維重度向椎間盤內(nèi)凸入，呈指狀突起，伸展至髓核內(nèi)部，甚至

10、髓核與內(nèi)層纖維環(huán)結構不清，按Nishimura標準分級為4-5級。 3.2退變椎間盤Ⅱ型膠原蛋白免疫組化染色 退變組4周染色見整個椎間盤呈現(xiàn)出淡黃色樣，髓核中央深黃褐色陽性反應不明顯，整個椎間盤結構不清，退變組8周后再次行Ⅱ型膠原蛋白免疫組化見中央髓核區(qū)域陽性反應不明顯，結構紊亂。 4.可注射式組織工程髓核移植治療椎間盤退變 4.1正常對照組及移植組椎間盤HE染色顯示椎間盤結構清晰，髓核組織及外周纖維環(huán)分

11、界清晰，細胞核及細胞漿染色明顯，缺損退變組顯示椎間盤結構紊亂，髓核組織和外周纖維環(huán)分界不清； 4.2Aggrecan番紅O染色提示正常對照組及移植組椎間盤染色明顯，椎間盤結構清晰，缺損退變組顯示椎間盤結構紊亂，髓核組織和外周纖維化分界不清； 4.3Ⅱ型膠原免疫組織化學染色：正常對照組以中央髓核組織染色為主，呈黃褐色陽性反應，整個椎間盤結構清晰，移植治療組中央髓核組織呈陽性反應，細胞間質中可見明顯黃褐色，大體結構仍保持完整

12、，缺損退變組染色較前兩組淺，且結構不清； 4.4椎間盤Ⅱ型膠原蛋白、蛋白聚糖RT-PCR檢測結果顯示正常組椎間盤組織與移植治療組的椎間盤組織在Aggrecan和II-collagen基因表達上無明顯差異(p>0.05)，同時發(fā)現(xiàn)缺損退變組Aggrecan和II-collagen的表達明顯下調(diào)，并與正常組及移植治療組有明顯差異(p<0.05)。 結論: 1.骨髓間充質干細胞來源廣泛，取材簡單且具有向類髓核細胞分化的