組織工程化髓核種子細(xì)胞優(yōu)化獲取的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　椎間盤退變?yōu)檠惩粗饕蛑?，其退變主要是由于椎間盤細(xì)胞減少和細(xì)胞外基質(zhì)成份的改變，盡管并沒明確椎間盤內(nèi)細(xì)膽的性質(zhì)，但是研究表明：髓核細(xì)胞與軟骨細(xì)胞在某些方面有很多共性.近年來研究表明：細(xì)胞移植可以達(dá)到組織功能上的修復(fù)，所以此方法最有希望成為治療椎間盤退變的最佳辦法.因?yàn)楦杉?xì)胞可以向軟骨樣細(xì)胞方面分化，所以大部分學(xué)者主要通過改變細(xì)胞外環(huán)境等來研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨樣細(xì)胞分化.最近研究表明：人體脂肪組織中的脂肪干細(xì)

2、胞含量較豐富，而脂肪干細(xì)胞在不同的獲取技術(shù)下可分化為軟骨樣細(xì)胞，如轉(zhuǎn)基因和不同生長因子聯(lián)合誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞向軟骨樣細(xì)胞分化技術(shù).所以我們設(shè)計(jì)這個(gè)試驗(yàn)就是為了探索比較體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone、Marrow Msenchymal Stem Cells，BMSCs)和脂肪干細(xì)胞(Adipose Stem Cells，ASCs)變化，以及堿性成纖維細(xì)胞生長因子(Basic Fibroblast Growth Factor，BFGF)對

3、其代謝的影響.
　　方法：
　　1．抽取日本大耳白兔骨髓，用全骨髓培養(yǎng)法進(jìn)行BMACs的體外培養(yǎng)、擴(kuò)增.取日本大耳白兔肩胛間的脂肪組織，在0．075％Ⅱ型膠原酶溶液中下剪碎并消化1小時(shí)(37℃)，所得的消化液過濾離心獲取脂肪干細(xì)胞，進(jìn)行體外單層培養(yǎng)擴(kuò)增，所收集的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞分別用DMEM、DME/F12(2：1)、α-MEM培養(yǎng).倒置顯微鏡觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞的形態(tài)改變，分別比較兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

4、和脂肪干細(xì)胞的數(shù)量.
　　2．當(dāng)細(xì)胞傳三代后，胰蛋白酶消化收集的脂肪干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞沉淀以2×105/ml接種到24cm2的培養(yǎng)瓶里，用軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Chondrogenic、Medium，CM)進(jìn)行誘導(dǎo)，CM的組成：1．25mg/ml牛血清白蛋白、10ng／mlTGF-β1、100nmol／L地塞米松、50μg／mL維生素C、100μg／mL丙酮酸鈉、40μg／mL脯氨酸、1％ITS-plus(10mg/ml胰島素，6

5、．7mg/ml亞硒酸鈉，5．5mg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，2ng／ml乙醇胺)的DMEX/F12(2：1)培養(yǎng)液
　　3．免骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞分為4組后分別進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)三周，即A組，BMSs+CM;B組，BMSC+CM+5ng／mlBFGF；C組，ASCs+CM；D組，ASCs+CM+5ng／mlBFGF，測定培養(yǎng)液上清羥脯氨酸含量和譬35SO42-基摻入量.
　　結(jié)果：
　　1.α-MEM培養(yǎng)基比DME、DMEM、

6、/F12(2：1)制備的BMSCs和ASCs所需時(shí)間大大縮短.
　　2．單層培養(yǎng)：單層培養(yǎng)的BMSCs和ASCs增殖較快貼壁較牢且生成細(xì)胞集落，然而在CM誘導(dǎo)后，細(xì)胞增殖較慢，貼壁不牢，且細(xì)胞沒有集落生成.
　　3．誘導(dǎo)后的BMSCs和ASCs的形狀趨向于類圓形，B組的細(xì)胞數(shù)量比A組的細(xì)胞多，D的細(xì)胞數(shù)量比C組的細(xì)胞多.B組比A組表達(dá)的羥脯氨酸增加,35SO42-攝入量增加，D組分別比C組表達(dá)羥脯氨酸增加、35SO42-攝入