ADSCs與β-TCP結(jié)合構(gòu)建組織工程人工聽骨的實驗研究.pdf

1、目的：觀察豚鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)與β-磷酸三鈣(β-TCP)材料體外復(fù)合培養(yǎng)的結(jié)合程度，并分析其構(gòu)建組織工程人工聽骨的可行性。
　　方法：(1)采用細(xì)胞差速貼壁法分離培養(yǎng)、純化豚鼠 ADSCs，使用流式細(xì)胞儀檢測 CD29、CD45、CD44進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物鑒定。采用將第三代的ADSCs分別向成骨、成脂肪、成神經(jīng)方向誘導(dǎo)分化；倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，誘導(dǎo)后進(jìn)行成骨、成脂肪、成神經(jīng)特異鑒定，檢測其多向分

2、化能力。(2)將豚鼠ADSCs與β-TCP共培養(yǎng)7天，電鏡觀察體外培養(yǎng)的ADSCs與此種支架材料的復(fù)合情況；(3)將用Brdu標(biāo)記后的豚鼠ADSCs與β-TCP復(fù)合培養(yǎng)7天后植入豚鼠聽泡模型，在12周取出組織工程人工聽骨進(jìn)行病理學(xué)觀察及掃描電鏡觀察材料的成骨能力。
　　結(jié)果：(1)細(xì)胞培養(yǎng)的檢測：①ADSCs的檢測：第三代的ADSCs形態(tài)均一，呈單層生長，細(xì)胞多為長梭形，呈旋渦狀排列；其表面標(biāo)記物CD29、CD44和CD45表達(dá)分

3、別為86.3％、55.5%、0.4%；②多向分化檢測：成骨誘導(dǎo)后倒置顯微鏡下可見細(xì)胞具有成骨細(xì)胞形態(tài)特征；茜素紅染色細(xì)胞間可見紅染的鈣結(jié)節(jié)，von-Kossa染色后可見大片棕褐色顆粒，堿性磷酸酶染液檢測染色后可見大片藍(lán)紫色顆粒。成脂誘導(dǎo)可見脂質(zhì)滴的數(shù)量逐漸增多，油紅O染色可見脂質(zhì)滴被染成紅色。成神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)可見細(xì)胞慢慢聚成團(tuán)狀，懸浮在培養(yǎng)液中，分裂增殖明顯迅速形成團(tuán)狀的類神經(jīng)球，貼壁后免疫熒光染色nestin陽性和GFAP陽性。此后更換

4、為成神經(jīng)分化培養(yǎng)液，部分細(xì)胞胞體稍有回縮，并伸出少量細(xì)長突起，呈現(xiàn)類神經(jīng)元樣改變，這些細(xì)胞少部分為NF200陽性表達(dá)。(2)體外復(fù)合培養(yǎng)7天后，電鏡下可見ADSCs貼附在材料表層，形態(tài)穩(wěn)定，生長旺盛，增殖力強(qiáng)，具有極佳的延伸性(3)回植后的組織工程人工12周HE染色后骨板間發(fā)現(xiàn)骨組織特異性的結(jié)構(gòu)-骨陷窩，其內(nèi)有骨細(xì)胞，無巨噬細(xì)胞和多核巨細(xì)胞存在，證明了組織工程人工聽骨已在體內(nèi)向成骨方向轉(zhuǎn)化，且與周圍組織具有良好的生物相容性。免疫熒光染色