胰腺組織工程載體—胰腺體尾部去細胞化支架的制備及其初步應用.pdf

1、本文對胰腺組織工程載體—胰腺體尾部去細胞化支架的制備及其應用進行了研究。本研究分為兩個部分：
　　第一部分：大鼠選擇性胰腺去細胞化支架的制備和評價。
　　目的：通過去細胞技術，經(jīng)全新的動脈灌注途徑，創(chuàng)新性選擇胰腺體尾部作為灌注主體，以制備大鼠胰腺體尾部去細胞化生支架，并全面評價所獲得支架的去細胞化程度、細胞外基質構成、脈管結構特性、生物活性和組織相容性等。
　　方法：①結合大鼠胰腺解剖，經(jīng)動脈途徑插管，選擇相對獨立的大

2、鼠胰腺體尾部作為灌注主體，并優(yōu)化灌注流程，以制作大鼠胰腺體尾部去細胞化支架。②通過大體肉眼觀察、HE染色及免疫組化評價胰腺支架的去細胞化效能，通過膠原蛋白含量分析和氨基聚糖含量檢測評價去細胞化后支架的基質構成成分，通過DNA定量分析檢測胰腺去細胞化的支架的有核細胞殘留情況，通過美蘭灌注染色及活體動脈對接觀察支架的宏觀脈管結構及循環(huán)密閉性，及通過透射及掃描電鏡觀察去細胞化支架的微觀三維脈管結構，并通過胰腺去細胞化支架的皮下包埋移植分析以評

3、價其免疫原性，并通過檢測支架內部細胞因子的含量分析其生物活性以及通過MTT法對去細胞化支架進行毒性分析。
　　結果： ①成功經(jīng)胃左動脈插管，順利游離胰腺體尾部分葉，經(jīng)優(yōu)化后的灌注流程，穩(wěn)定且可規(guī)?；@得大鼠胰腺體尾部去細胞化生物支架。②大體觀察可見灌注中，胰腺外觀膨隆，內部脈管閉合性良好，胰腺組織逐漸由實體轉變?yōu)橥该? HE染色及免疫組化均可觀察到去細胞化后的支架內無殘留的腺泡或胰島細胞結構;多種膠原蛋白表達情況表明了支架保留了完

4、整的基質成分，結合掃描及透射電鏡分析顯示了去細胞化支架內清晰的脈管網(wǎng)絡結構。DNA定量分析顯示去細胞化后支架的DNA含量為（42.3±10.6）ng/mg，符合去細胞化后 DNA殘留量的最低標準;而美蘭染色結果和動脈對接后的血液支架內灌注顯示了去細胞化支架良好的循環(huán)密閉性；結合免疫原性分析和MTT分析，獲得的胰腺去細胞化支架無明顯排斥反應及細胞毒性，具有良好的生物相容性;細胞因子檢測也表明支架內部仍保留部分生物活性。
　　結論：經(jīng)

5、胃左動脈插管，創(chuàng)新性的選擇胰腺體尾部作為灌注主體，能夠制備良好的大鼠胰腺去細胞支架，且經(jīng)全面評價，保留了完整的基質成分和脈管結構，并且具備良好的免疫原性和生物相容性，此外，與所有現(xiàn)有的支架相比，選擇性的胰腺體尾部灌注使得獲得的去細胞化支架能夠形成具備共同入路和出路的循環(huán)閉合體,使其更有助于回填細胞的粘附和種植培養(yǎng)以及后續(xù)的體內移植應用和研究。
　　第二部分：大鼠胰腺去細胞化支架體外再細胞化培養(yǎng)和體內移植研究。
　　目的：研究

6、前述大鼠胰腺去細胞化支架的體內外應用價值，探討胰島β細胞（INS-1 E）在去細胞化三維支架內的回填再細胞化情況，并評價去細胞化支架對INS-1 E生長、擴增和分泌功能的影響。并進一步研究再細胞化胰腺支架在體內以不同方式移植后INS-1 E的功能狀態(tài)和對糖尿病大鼠的治療作用。
　　方法：⑴大鼠INS-1 E胰島細胞株擴增達到15*106后通過動脈入路注射回填到去細胞化支架內，待細胞貼壁后，持續(xù)循環(huán)灌注完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3天，同時與支架

7、切片和胰島細胞共培養(yǎng)的方式進行比較研究。我們采用高、低糖刺激實驗來評價細胞定植后的支架內胰島細胞的胰島素分泌功能，通過HE染色分析和免疫熒光檢測評估回填后的支架內細胞再細胞化情況。⑵大鼠內皮細胞以相同方法回填種植到去細胞化支架內，行HE及免疫熒光染色分析。⑶通過腹腔注射鏈脲左菌素（STZ）法制作大鼠Ⅰ型糖尿病模型。⑷成年雄性糖尿病SD大鼠共54只，隨機分為9組：A組--空白支架整體移植組；B1組--空白支架切片大網(wǎng)膜移植組；B2組--空

8、白支架切片腎周脂肪囊移植組；C組—再細胞化支架整體移植組；D1組--支架切片后與細胞共培養(yǎng)大網(wǎng)膜移植組；D2組--支架切片后與細胞共培養(yǎng)腎周脂肪囊移植組；E組--胰島細胞經(jīng)門靜脈注射移植組；F組--實驗對照組；G組--正常對照組。⑸所有行移植手術的大鼠術前頸內靜脈置管經(jīng)皮下包埋固定于背部用于移植前后受體肝素化及術后補液和靜滴抗生素預防感染。A組、C組整體移植首先需要切除受體大鼠一側腎臟，保留該側腎動、靜脈，預留出該側腎周脂肪囊空間，將移

9、植物--胰腺體尾部支架的動脈入路與腎動脈對接，靜脈出入與腎靜脈對接，并將移植物置入腎周脂肪囊內完成移植。而B組、D組支架切片移植需將支架切成長約1.5cm，寬約1cm，高約1c m組織塊，與大網(wǎng)膜或者腎周脂肪囊做包埋完成移植。E組經(jīng)門靜脈注射移植則將相同數(shù)量級的胰島細胞一次性注射至門靜脈完成移植。F組其中3只糖尿病大鼠行左腎切除，3只僅行剖腹探查作為實驗對照。G組即未經(jīng)任何干預的糖尿病大鼠作為正常對照組。⑹通過檢測受體小鼠術后多個特定時

10、間點的血糖動態(tài)變化，及組織學HE染色、免疫熒光染色等進行移植后移植物的功能狀態(tài)評價和降糖效果分析。
　　結果：①支架切片共培養(yǎng)結果顯示，內皮細胞和胰島細胞能夠順利貼壁， HE染色見支架內散在細胞定植。而整體支架注射種植后循環(huán)灌注培養(yǎng)可見胰腺支架顏色由透明逐漸變?yōu)辄S白色，培養(yǎng)3天后HE染色見支架脈管結構內可見較多種植細胞粘附排列，并可見部分細胞進入支架內部原實質空間，并定植聚集。高、低濃度糖刺激試驗顯示，兩種培養(yǎng)方式下的胰島細胞均具

11、有較好的胰島素分泌功能。②各組大鼠移植過程均順利完成，循環(huán)對接移植手術時間最長，平均90分鐘，而部分支架移植平均手術時間50分鐘，門靜脈注射移植平均手術時間30分鐘。整體支架循環(huán)對接移植組中， A組出現(xiàn)一只大鼠術后4小時死亡，考慮并發(fā)嚴重腦部、肺部栓塞死亡。C組另有一只大鼠術后并發(fā)嚴重持續(xù)低血糖（術后血糖值1.9-2.1mmol/L）于術后8小時死亡。各組其余大鼠均存活4周以上，未發(fā)現(xiàn)有嚴重的排斥反應和明顯的腹腔感染。③再細胞現(xiàn)化支架整

12、體移植組（C組）大鼠術后4小時內血糖逐漸開始下降（11.5±3.2mmol/L），術后8小時血清血糖水平降至6.8±3.6 mmol/L（P＜0.05），術后1周開始血糖出現(xiàn)高低波動，并且逐漸上升，至術后4周血糖達到13.7±4.2mmol/L。支架切片后與細胞共培養(yǎng)組（D1、D2組）大鼠術后8小時血糖開始下降（分別為11.8±1.5 mmol/L，9.5±3.3 mmol/L），24小時分別降至4.2±1.7 mmol/L、5.3±2

13、.1 mmol/L（P＜0.05），維持1周后血糖開始回升。通過進一步移植物的組織病理學和免疫熒光分析，結合血糖監(jiān)測結果證實，與對照組比較，移植組織能夠在受體內存活，并建立胰島素分泌途徑，發(fā)揮控制血糖的治療作用。但支架循環(huán)對接移植組并未顯示出明顯優(yōu)于門靜脈注射移植的降糖效果。
　　結論：結果證明，我們制備的新型胰腺體尾部去細胞化支架模型除了具備和其它國內外研究相一致的體外培養(yǎng)的研究應用價值，而且在基于該去細胞化支架的全新胰島細胞移