體外培養(yǎng)角膜緣上皮細胞重建眼表的實驗研究.pdf

1、角膜感染、外傷、熱及化學(xué)性燒傷、先天性異常、反復(fù)復(fù)發(fā)的翼狀胬肉和腫瘤等疾病嚴重損傷眼表組織，造成視力下降，甚至致盲。角膜盲的患者在盲病人中占相當(dāng)比例，由于眼表疾病以及角膜緣干細胞缺失所導(dǎo)致的角膜盲欠缺有效治療手段，故對其治療一直是步履蹣跚。粘膜或結(jié)膜移植眼表重建手術(shù)的臨床效果較差，因為粘膜和結(jié)膜與角膜上皮表型不同而不能恢復(fù)眼表正常的形態(tài)與功能，最終導(dǎo)致新生血管化。同種異體板層角膜移植供體來源匱乏，冷凍保存的植片由于角膜緣干細胞的失活不能

2、改善重建正常的眼表。 隨著對角膜緣干細胞在維持眼表中的重要作用的不斷認識，角膜緣干細胞移植成為目前的研究熱點。1998年12月美國科學(xué)家在《science》上報導(dǎo)，成功地在體外培養(yǎng)和擴增了人體胚胎干細胞，這一研究為利用干細胞治療疾病提供了理論依據(jù)。一年之后，美國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)小鼠肌肉組織的成體干細胞可以“橫向分化”為血液細胞，這一發(fā)現(xiàn)陸續(xù)被世界各國科學(xué)家所證實。隨著研究的深入，人們還發(fā)現(xiàn)人類的成體干細胞同樣具有“橫向分化”的功能，這

3、也表明人類有望利用患者自身健康組織的干細胞，定向誘導(dǎo)分化成有功能的細胞用于治療疾病。隨著干細胞研究的深入，組織工程學(xué)也應(yīng)運而生，組織工程技術(shù)的興起為解決眼表重建的難題帶來了希望。組織工程技術(shù)的基本方法是取少量自體健康角膜緣組織，體外培養(yǎng)擴增后種植于一種生物相容性良好的載體上，組成復(fù)合角膜上皮植片后移植到患側(cè)眼表。其優(yōu)點在于：取材量少、健眼損傷小、解決了供體來源問題、不存在免疫排斥反應(yīng)。角膜緣干細胞經(jīng)體外培養(yǎng)后其抗原性會有所降低，這就更有

4、利于異體移植。因此，角膜緣干細胞培養(yǎng)后移植解決了干細胞來源不足的問題，對異體角膜緣干細胞的體外培養(yǎng)是目前研究的重點，是治療眼表疾病最有前途的治療方法。目前角膜緣干細胞理想的培養(yǎng)體系還處于探索研究階段，正確獲取培養(yǎng)用角膜緣組織是體外成功培養(yǎng)角膜緣干細胞的首要因素，但由于角膜緣干細胞缺乏明確的陽性標志，對其的研究一直在進行中。還有角膜緣干細胞體外培養(yǎng)時，細胞增殖、分化等過程的調(diào)節(jié)受許多因素制約，其中許多環(huán)節(jié)人們還知之甚少。如能在這些方面有所

5、突破，有望產(chǎn)生巨大的社會效益和經(jīng)濟效益，并為數(shù)以十萬計的角膜盲患者帶來福音。 基于上述，本實驗研究利用組織工程學(xué)、細胞生物學(xué)和干細胞與干細胞工程學(xué)的基本原理與方法，試圖在體外成功培養(yǎng)角膜緣干細胞、構(gòu)建組織工程化角膜上皮，并將組織工程化角膜上皮移植于動物模型，以達到重建眼表、恢復(fù)角膜表面的光滑和透明，恢復(fù)眼表面較為正常的解剖結(jié)構(gòu)和功能，為進一步組織工程化眼表重建奠定理論和實驗基礎(chǔ)。 在本研究中應(yīng)用體外組織培養(yǎng)方法，對兔角膜

6、上皮前體細胞或角膜緣干細胞(祖細胞)存在的確切部位和生理特性、在完整羊膜和去上皮層羊膜為載體培養(yǎng)的生物學(xué)特性和以去上皮層羊膜為載體培養(yǎng)后自體及異體移植治療全角膜緣干細胞缺損以及臨床應(yīng)用等情況進行了實驗，主要方法和結(jié)果概括如下： 一．應(yīng)用體外組織培養(yǎng)方法，以兔角結(jié)膜分界線(Cornea-Conjiuctiva LineCCL)為基準，分成8個定位區(qū)帶，并分別以12點、3點、6點、9點為中心，取材進行體外培養(yǎng)。逐日觀察細胞成膜狀態(tài)，

7、測量成膜面積并進行統(tǒng)計學(xué)分析。 結(jié)果顯示：1．角膜緣不同區(qū)域的上皮組織在細胞生長時間、成膜時間、成膜速率以及成膜類型方面具有明顯差異(P<0.01)，角膜緣附近的角膜上皮細胞生長最快、出膜最早、膜狀態(tài)最好。2．CCL內(nèi)各區(qū)組培養(yǎng)后均無成纖維細胞出現(xiàn)；而CCL外各區(qū)組培養(yǎng)后可見成纖維細胞，距CCL線越遠成纖維細胞數(shù)量越多。3．水平方位與垂直方位即12點位、6點位、3點位和9點位的角膜上皮前體細胞成膜形態(tài)與成膜規(guī)律的比較，發(fā)現(xiàn)二者不

8、存在明顯差晃(P>0.05)。4．角膜緣附近的角膜上皮細胞體外培養(yǎng)形成的膜都是完整、均質(zhì)、透明的，當(dāng)膜在其增長過程中，可將擴展范圍內(nèi)的成纖維細胞化解。 提示： 1．角膜緣不同定位區(qū)組織細胞形成膜的特性不同，含有干細胞的角膜緣附近的角膜上皮細胞生長最快、出膜最早、膜狀態(tài)最好。2．角膜緣部柵欄組織的豐富程度與角膜上皮前體細胞的數(shù)量及功能未必存在一致關(guān)系。 3．角膜緣干細胞形成的膜有保持其透明性及排它性的生理特性。4．進行角膜緣干細胞

9、體外培養(yǎng)，從CCL附近取材較為適宜。 二．對兔角鞏膜緣不同定位區(qū)的角結(jié)膜上皮細胞進行體外組織培養(yǎng)，探討了角膜緣干細胞的生理特性。 結(jié)果顯示：1．當(dāng)角膜緣上皮細胞形成的膜片相互融合時，他們之間是兼容連接，最終形成的膜片之間無連接的痕跡。 2．當(dāng)角膜緣上皮細胞形成的膜片與結(jié)膜上皮細胞形成的成纖維細胞融合時出現(xiàn)相互競爭現(xiàn)象。 3．角膜緣存在有角膜緣干細胞，角膜緣上皮細胞形成的膜有保持其透明性及排它性的生理表現(xiàn)。提示：1．角膜緣

10、上皮細胞和結(jié)膜上皮細胞存在相互競爭機制，為角膜緣干細胞缺乏癥引起的角膜結(jié)膜化提供了必要的實驗基礎(chǔ)。2．角膜緣存在有角膜緣干細胞，角膜緣干細胞對維持角膜的透明性和正常生理功能有重要意義。 三．采用組織塊培養(yǎng)法，將角膜緣及角膜中心組織塊分別種植于完整羊膜和去上皮層羊膜上進行培養(yǎng)，觀察并比較在完整羊膜、去上皮層羊膜為載體培養(yǎng)兔角膜上皮細胞的生物學(xué)特性。結(jié)果顯示：1．角膜上皮細胞在去上皮層羊膜上培養(yǎng)成膜速率與成膜面積方面均快于在完整羊膜

11、上培養(yǎng)，去上皮層羊膜更利于角膜上皮細胞的生長。2．角膜上皮細胞在完整羊膜上培養(yǎng)，當(dāng)膜在其增長過程中，需將擴展范圍內(nèi)的羊膜上皮細胞推開，膜才能繼續(xù)增長。提示：1．不同性質(zhì)羊膜為載體對角膜上皮細胞的生物學(xué)特性有一定的影響，去上皮層羊膜更利于角膜上皮細胞的生長，可作為一個良好的載體用于移植。 2．角膜上皮細胞具有排它性的生理特性，對維持角膜的透明性和正常生理功能有重要意義。 四．制作兔眼(以右眼為實驗眼)角膜緣干細胞完全缺損模型3個月

12、，將實驗動物隨機分為兩組即實驗組和對照組。實驗組取對側(cè)眼角膜緣組織以去除上皮細胞的羊膜基底膜為載體制成組織工程角膜上皮，約培養(yǎng)后12天行角膜緣干細胞羊膜移植術(shù)；對照組行單純羊膜移植術(shù)(僅將刮除上皮的羊膜)，術(shù)后觀察3個月。以角膜上皮染色，角膜渾濁和新生血管三項指標進行臨床療效評定，通過病理檢查評估術(shù)后角膜上皮修復(fù)情況，印跡細胞學(xué)檢查移植前后角膜上皮的細胞表型。結(jié)果顯示：1．體外培養(yǎng)的兔角膜緣干細胞可在羊膜上粘附生長并增殖。2．自體角膜緣

13、干細胞移植術(shù)后兔角膜緣輕度充血、角膜上皮逐漸愈合，透明度提高，基質(zhì)細胞浸潤減輕，新生血管減退或消失。印跡細胞學(xué)檢查顯示：移植前角膜上皮細胞PAS(+)，而移植后角膜上皮細胞PAS(-)；組織病理學(xué)顯示：移植前角膜上皮大部分缺損，移植后角膜上皮為角膜上皮結(jié)構(gòu)。提示：以羊膜為載體培養(yǎng)角膜緣上皮細胞可體外重建組織工程角膜上皮組織，自體角膜緣干細胞羊膜移植術(shù)可修復(fù)角膜緣干細胞缺損。 五．制作兔眼角膜緣干細胞完全缺損3個月的模型，將實驗動

14、物隨機分為兩組即自體移植組和異體移植組。自體移植組取對側(cè)眼角膜緣組織，異體移植組取健康的兔眼角膜緣組織，均以去除上皮細胞的羊膜基底膜為載體，培養(yǎng)12天后行角膜緣干細胞羊膜移植術(shù)。術(shù)后觀察3個月，以角膜上皮染色、角膜渾濁和新生血管三項指標進行臨床療效評定，通過病理檢查評估術(shù)后角膜上皮修復(fù)情況，印跡細胞學(xué)檢查移植前后角膜上皮的細胞表型。 結(jié)果顯示：體外培養(yǎng)的兔角膜緣干細胞可在羊膜上粘附生長并增殖，體外培養(yǎng)12天可形成復(fù)層。自體移植組

15、和部分異體移植組術(shù)后角膜上皮逐漸愈合，透明度提高，基質(zhì)細胞浸潤減輕，新生血管減退或消失。印跡細胞學(xué)檢查顯示：移植前角膜上皮細胞PAS(+)，而移植后轉(zhuǎn)為(-)；組織病理學(xué)顯示：移植前角膜上皮大部分缺損，移植后呈現(xiàn)角膜上皮結(jié)構(gòu)。部分異體移植組術(shù)后出現(xiàn)了免疫排斥反應(yīng)。提示：自體角膜緣干細胞羊膜移植術(shù)可重建眼表；免疫排斥反應(yīng)仍是異體角膜緣干細胞羊膜移植術(shù)失敗的主要原因。 六．我們選擇兩例眼燒傷后重度瞼球粘連患者，觀察以去除上皮細胞的人

16、羊膜基底膜為載體，自體血清培養(yǎng)異體角膜緣上皮細胞后移植治療眼燒傷后重度瞼球粘連，術(shù)后觀察結(jié)膜囊情況、眼球活動、角膜植片免疫排斥反應(yīng)情況和轉(zhuǎn)歸情況。探討以人自體血清、人羊膜為基底膜培養(yǎng)角膜緣上皮細胞后移植治療眼燒傷后重度瞼球粘連的眼表重建效果。結(jié)果顯示：術(shù)后患者自覺癥狀輕，視力有所提高，角膜緣干細胞移植片緊密貼附，角膜上皮得到修復(fù)，淺層新生血管減少，瞼球粘連得到松解。提示：自體血清培養(yǎng)異體角膜緣上皮細胞后移植是治療眼燒傷后重度瞼球粘連的有

17、效方法。本研究通過體外培養(yǎng)角膜緣上皮細胞生理特性，進一步證實了角膜干細胞存在于角膜緣的觀點，驗證了角膜緣干細胞對維持角膜的透明性和正常生理功能有重要意義的說法。通過觀察并比較在完整羊膜與去上皮細胞層羊膜為載體培養(yǎng)兔角膜緣上皮細胞的生物學(xué)特性，表明去上皮細胞層羊膜可作為一個良好的載體用于移植。并以去上皮細胞羊膜作為載體，經(jīng)培養(yǎng)后用于移植于全角膜緣干細胞缺損模型，可達到重建眼表。通過以去上皮細胞羊膜作為載體，人自體血清培養(yǎng)異體角膜緣上皮細胞