毛囊bulge干細(xì)胞向角膜上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化并重建眼表的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、疾病、外傷等各種原因造成角膜緣干細(xì)胞缺如或功能不良時，角膜透明性喪失，嚴(yán)重影響視力，通常最佳的方法是自體角膜緣移植。但對于雙眼角膜緣廣泛損傷的患者，自體角膜緣干細(xì)胞嚴(yán)重缺乏而限制了此治療方式。近年來非眼源性干細(xì)胞在角膜上皮重建中的研究和應(yīng)用受到重視，主要集中在胚胎干細(xì)胞、口腔黏膜祖細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和表皮干細(xì)胞等。目前認(rèn)為毛囊外根鞘的bulge區(qū)域存在大量的成體干細(xì)胞，其取材簡便，來源豐富，且具有多向分化能力，正作為一種新興的種子細(xì)

2、胞。本實(shí)驗(yàn)的目的是探討毛囊bulge區(qū)的干細(xì)胞是否具有向角膜上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的能力，并能夠作為修復(fù)角膜上皮的一種細(xì)胞來源。研究表明，干細(xì)胞的分化與轉(zhuǎn)分化常受多種因素的調(diào)節(jié)，Pax6在角膜上皮發(fā)育分化中具有主控作用，并在維持角膜上皮的正常功能中具有不可忽視的功能；Wnt信號途徑也對許多成體干細(xì)胞包括毛囊干細(xì)胞的增殖分化起重要的調(diào)節(jié)作用。 為此，本論文首先研究在體外特定誘導(dǎo)環(huán)境中毛囊bulge干細(xì)胞向角膜上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的能力，并對誘導(dǎo)

3、分化過程中Pax6和β-catenin/Lef-1的表達(dá)變化進(jìn)行研究。繼后重點(diǎn)研究了Pax6的作用機(jī)制，最后對毛囊bulge干細(xì)胞在體內(nèi)重建角膜上皮的作用進(jìn)行了觀察，主要結(jié)果如下： 1、毛囊bulge干細(xì)胞培養(yǎng)鑒定和生物學(xué)性狀的研究 采用IV型膠原快速黏附的方法富集毛囊bulge區(qū)干細(xì)胞，體外培養(yǎng)，并對其生物學(xué)性狀進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：IV型膠原篩選的方法能較好地獲得毛囊bulge干細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng)。細(xì)胞形態(tài)均一，核漿比

4、大，表現(xiàn)出早期幼稚細(xì)胞的形態(tài)特征。細(xì)胞克隆形成率結(jié)果顯示細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力，克隆形成率高。體外培養(yǎng)的毛囊bulge干細(xì)胞表達(dá)特異性標(biāo)志CD34和整聯(lián)蛋白α6。 2、毛囊bulge干細(xì)胞向角膜上皮樣細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化 在體外成功培養(yǎng)毛囊bulge干細(xì)胞的基礎(chǔ)上，我們用角膜緣的組織勻漿制備誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)毛囊bulge干細(xì)胞分化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：毛囊bulge干細(xì)胞在體外適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)培養(yǎng)條件下能轉(zhuǎn)分化為角膜上皮樣細(xì)胞，表達(dá)角膜上

5、皮特異性標(biāo)志K12。在毛囊bulge干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的過程中，Pax6的表達(dá)上調(diào)，對轉(zhuǎn)分化過程起促進(jìn)作用。在毛囊bulge干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的過程中，Wnt信號途徑受到抑制，表現(xiàn)為Lef-l表達(dá)下降，β-catenin從胞核向胞漿轉(zhuǎn)位。誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞能在體外形成類似正常角膜上皮的屏障功能。 3、Pax6在角膜上皮樣細(xì)胞分化中的作用 實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)大鼠觸須中的毛囊組織中也有Pax6的表達(dá)，與角膜上皮類似，但不同的是表達(dá)以另一個剪接體P

6、ax6-5a為主。通過轉(zhuǎn)染使毛囊bulge干細(xì)胞過表達(dá)Pax6發(fā)現(xiàn)，Pax6能啟動部分毛囊bulge干細(xì)胞表達(dá)角蛋白K12，提示毛囊bulge干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中Pax6發(fā)揮了重要的作用，該作用是直接調(diào)節(jié)角膜上皮特異性角蛋白K12的表達(dá)。但Pax6的過表達(dá)并不能抑制β-catenin和Lef-1的作用，只有在條件培養(yǎng)基中才能引起β-catenin和Lef-1的下調(diào)，說明轉(zhuǎn)分化過程中β-catenin和Lef-1的下調(diào)來源于角膜緣微環(huán)境的作

7、用，與角膜組織中的DKK2的表達(dá)有關(guān)。 4、毛囊bulge干細(xì)胞在體重建角膜上皮的作用 運(yùn)用堿燒傷處理制備角膜緣干細(xì)胞缺失病理動物模型，借助一種新型溫度敏感型生物材料PIPAAm制備無載體的細(xì)胞片層移植到受損的角膜表面。結(jié)果發(fā)現(xiàn)毛囊bulge干細(xì)胞能夠重建受損的角膜上皮，能改善角膜的透明度，抑制新生血管的形成。毛囊bulge干細(xì)胞能夠在角膜表面形成K12表達(dá)陽性的上皮層。毛囊bulge干細(xì)胞的修復(fù)能抑制MMP2和MMP9

8、的表達(dá)，具有一定的抑制炎癥的作用，然而具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。 主要結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)毛囊bulge干細(xì)胞在體外具有向角膜上皮樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的能力，在誘導(dǎo)分化的過程中Pax6上調(diào)，而β-catenin和Lef-1受到抑制。其中Pax6是調(diào)節(jié)角膜上皮特異性角蛋白K12表達(dá)的重要因子。毛囊bulge干細(xì)胞在體內(nèi)也能轉(zhuǎn)分化為角膜上皮樣細(xì)胞，重建受損的角膜上皮。該實(shí)驗(yàn)為角膜上皮重建中種子細(xì)胞的來源開辟了一個新的途徑，也為角膜上皮