人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　體外分離并富集人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞(Glioblastoma stem cells，GSCs)，觀察其生物學(xué)特征，包括形態(tài)學(xué)、自我更新能力、多向分化潛能以及在NOD-SCID小鼠腦內(nèi)形成具有原發(fā)腫瘤相似表型的異種移植腫瘤的能力。
　　比較不同基因分型GSCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的潛能。觀察并描述體外人基質(zhì)細(xì)胞型GSCs轉(zhuǎn)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，包括在內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)后，形成管樣結(jié)構(gòu)并表達(dá)多個(gè)血管內(nèi)皮細(xì)胞

2、標(biāo)記物。
　　初步探討人基質(zhì)細(xì)胞型GSCs轉(zhuǎn)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的相關(guān)機(jī)制。分析HIF2α和Twsit1在人基質(zhì)細(xì)胞型GSCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程中的作用。
　　方法:
　　人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma multiforme，GBM)手術(shù)標(biāo)本的獲取均經(jīng)過(guò)患者書面知情同意，并得到復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。在無(wú)血清培養(yǎng)基（含EGF、bFGF、N2添加劑）中培養(yǎng)人GBM來(lái)源細(xì)胞。采用神經(jīng)球克隆形成實(shí)驗(yàn)

3、、免疫熒光技術(shù)及Western-blot等方法分別評(píng)估腫瘤干細(xì)胞的增殖、多向分化分化潛能及其干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)。采用流式細(xì)胞技術(shù)從人GBM來(lái)源的細(xì)胞中分選出CD133+和CD133-細(xì)胞。在無(wú)血清培養(yǎng)基中，比較CD133+和CD133-細(xì)胞的形態(tài)、克隆形成能力、侵襲和遷移能力以及多個(gè)干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)。將GBM來(lái)源的細(xì)胞注射到NOD-SCID小鼠腦內(nèi)，比較CD133+和CD133-細(xì)胞形成異種移植腫瘤的能力。采用HE染色及免疫組化技術(shù)分

4、析CD133+ GBM細(xì)胞異種移植腫瘤的病理特征及其表型。
　　通過(guò)基因芯片分析，將17例人GBM樣本分為經(jīng)典型、前神經(jīng)元型及基質(zhì)細(xì)胞型。將不同基因分型人GSCs在內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM/F-12培養(yǎng)基、添加10％胎牛血清、10 ng/ml VEGF、10 ng/ml N2 supplement、10 ng/ml EGF和5ng/ml bFGF）中誘導(dǎo)培養(yǎng)后，通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)比較其中血管內(nèi)皮祖細(xì)胞（CD144+細(xì)胞）的比例。三維

5、培養(yǎng)時(shí)，將100μl Matrigel加入到24孔板中，凝膠形成后將CD144+人基質(zhì)細(xì)胞型GSCs懸液加入到培養(yǎng)板中。在倒置顯微鏡下定期觀察細(xì)胞形態(tài)變化，通過(guò)免疫熒光、RT-PCR及Western-blot分析其中血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)，包括VE-Cadherin，CD31，F(xiàn)lk-1和Tie-2。
　　人GSCs分別在常氧(20％O2)和缺氧(1％O2)條件下培養(yǎng)。在低氧培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)缺氧環(huán)境。Western-blot分析這兩

6、種情況下Twist1和HIF-2α蛋白的表達(dá)。使用HIF2α或Twist1特異性的小干擾RNA下調(diào)人基質(zhì)細(xì)胞型GSCs中這兩種蛋白的表達(dá)。通過(guò)管樣形成實(shí)驗(yàn)及Western-blot技術(shù)來(lái)評(píng)估HIF2α和Twist1在人基質(zhì)細(xì)胞型GSCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程中的作用。
　　結(jié)果:
　　人GBM來(lái)源的細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中能夠增殖并形成腫瘤球。僅有少數(shù)（大約11.4％-18.6％）的人GBM來(lái)源細(xì)胞能夠形成腫瘤球。有限稀釋實(shí)驗(yàn)

7、表明單個(gè)細(xì)胞所形成的腫瘤球中的部分細(xì)胞具有無(wú)限增殖能力。在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，形成腫瘤球的細(xì)胞比例保持穩(wěn)定，表明人GSCs非對(duì)稱分裂。免疫熒光結(jié)果表明人GSCs能夠表達(dá)腦腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物，如CD133和Nestin。通過(guò)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)GFAP，βⅢ-tubulin和olig1的表達(dá)，結(jié)果表明人GSCs在有血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，其更傾向分化為星形細(xì)胞，同時(shí)也能夠多向分化為神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞，這說(shuō)明體外培養(yǎng)時(shí)GSCs具有多向分化潛能。

8、　　CD133被成功的用于分離和富集人GSCs。分散的CD133+細(xì)胞能夠在無(wú)血清培養(yǎng)基中形成腫瘤球并表達(dá)多個(gè)干細(xì)胞標(biāo)記物，而CD133-細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)中多呈現(xiàn)貼壁培養(yǎng)而無(wú)法形成腫瘤球。CD133+細(xì)胞較CD133-細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移及侵襲能力。將相同數(shù)目的人GBM細(xì)胞注射到NOD-SCID小鼠腦內(nèi)4周后，CD133+細(xì)胞能夠形成異種移植腫瘤，而CD133-細(xì)胞則無(wú)法形成。CD133+細(xì)胞形成的異種移植腫瘤具有GBM典型的病理學(xué)特征，

9、免疫組化結(jié)果表明CD133+細(xì)胞形成的異種移植腫瘤與病人原發(fā)腫瘤的表型相互匹配。
　　人GSCs在內(nèi)皮細(xì)胞分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)7天后，流式細(xì)胞分析結(jié)果表明在人基質(zhì)細(xì)胞型GBM中血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(CD144+)的比例較另外兩種亞型腫瘤顯著升高。在Matrigel上培養(yǎng)時(shí)，CD144+人基質(zhì)細(xì)胞型GSCs發(fā)生一系列的形態(tài)學(xué)變化:細(xì)胞之間形成稀疏連接、形成不連續(xù)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、形成連續(xù)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、形成繩索樣結(jié)構(gòu)并最終形成管樣結(jié)構(gòu)。透射電鏡結(jié)果表明

10、人基質(zhì)細(xì)胞型GSCs在轉(zhuǎn)分化后具有血管內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。RT-PCR及Western-blot結(jié)果表明轉(zhuǎn)分化后CD144+人基質(zhì)細(xì)胞型GSCs中血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物VE-Cadherin，CD31，F(xiàn)lk-1和Tie-2的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平均顯著升高。
　　免疫熒光結(jié)果表明人基質(zhì)細(xì)胞型GSCs表達(dá)EMT特征性標(biāo)記物，如Vimentin、Snail、Slug、Twist1和N-Cadherin。CD144+人基質(zhì)細(xì)胞型GSCs中HIF2

11、α和Twist1的表達(dá)較CD144-細(xì)胞顯著升高。低氧能夠促進(jìn)人基質(zhì)細(xì)胞型GSCs形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證管樣形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，我們使用Western-blot檢測(cè)多個(gè)血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)，結(jié)果表明低氧條件下包括CD31、Flk-1及VE-Cadherin在內(nèi)的多個(gè)血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)顯著高于常氧。RT-PCR及Western-blot結(jié)果表明缺氧情況下HIF2α和Twist1的mRNA及蛋白水平的表達(dá)均顯著升高。低氧情

12、況下，人基質(zhì)細(xì)胞型GSCs在內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中誘導(dǎo)后，HIF2α siRNA能顯著減少內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物以及Twist1的表達(dá)，并顯著降低其在Matrigel上形成管樣結(jié)構(gòu)的能力。當(dāng)Twist1被其特異性siRNA沉默后，血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31、Flk-1及VE-Cadherin的蛋白表達(dá)水平顯著下降，但HIF2α的表達(dá)水平無(wú)顯著改變。管樣形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Twist1 siRNA能顯著降低人基質(zhì)細(xì)胞型GSCs形成管樣結(jié)構(gòu)的能力。

13、　　結(jié)論:
　　人GBM來(lái)源的細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中能夠增殖并形成腫瘤球。人GSCs在含血清培養(yǎng)基中能夠多向分化。從人GBM中分離的CD133+細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞特征。在NOD-SCID小鼠大腦中，CD133+人GSCs能夠形成與病人原發(fā)腫瘤相似的異種移植腫瘤。
　　人基質(zhì)細(xì)胞型GSCs向內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的能力較經(jīng)典型及前神經(jīng)元型更強(qiáng)。人基質(zhì)細(xì)胞型GSCs在體外能夠轉(zhuǎn)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　低氧促進(jìn)人基質(zhì)細(xì)胞型GSCs向