膠質(zhì)瘤干細胞與微血管內(nèi)皮細胞相互作用及機制的研究.pdf

1、惡性膠質(zhì)瘤是目前嚴重危害人類健康的中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見腫瘤。盡管近年來采用手術(shù)加放療、化療的綜合治療的方案,使膠質(zhì)瘤患者的生存率有所提高,但大多數(shù)患者的預(yù)后仍然不理想,仍存在術(shù)后復(fù)發(fā)、對放療不敏感及化療藥物耐受等問題。近年腫瘤干細胞及其微環(huán)境理論認為上述這些問題與膠質(zhì)瘤干細胞(gliomastemcell,GSC)密切相關(guān),而GSC所處的微環(huán)境在其中起重要的調(diào)節(jié)作用。
　　為此本文采用體外transwell雙室共培養(yǎng)、PCR、West

2、ern-blot、RNAi基因干擾、ELISA檢測、細胞增殖和遷移實驗及與內(nèi)皮細胞共同移植的小鼠皮下膠質(zhì)瘤移植瘤模型等實驗技術(shù)方法分三個部分探討了GSC與內(nèi)皮細胞間的相互作用及可能機制:第一部分是從腫瘤實質(zhì)細胞的角度出發(fā)探討內(nèi)皮細胞對GSC干性特征(主要是自我更新能力)的影響及HH通路在其中所起的作用;第二部分是從內(nèi)皮細胞的角度出發(fā),探討GSC對內(nèi)皮細胞增殖遷移能力的影響及HH通路在其中所起的作用;第三部分是探索GSC與內(nèi)皮細胞相互作用

3、時HH通路激活的可能因素,得到如下主要實驗結(jié)果及結(jié)論:
　　主要結(jié)果:
　　1.內(nèi)皮細胞促進GSC自我更新和膠質(zhì)瘤細胞干性特征的表達。
　　1.1極限稀釋實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)后的GSC形成干細胞球數(shù)目明顯增多,體積明顯增大,尤其在每孔5個(24.3％vs11.3%)和每孔10個細胞(39.4%vs25.8%)的極低濃度下更加明顯。與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)后的GL261細胞形成干細胞球體積也明顯增加。

4、r>　　1.2小鼠皮下移植瘤實驗證明與內(nèi)皮細胞共注射的GSC成瘤能力更強,瘤體體積顯著大于對照組(0.87±0.25cm3VS0.23±0.046cm3)。與內(nèi)皮細胞共注射的GL261細胞成瘤能力也比對照組顯著增強(0.093±0.068cm3VS0.039±0.043cm3)。
　　1.3PCR實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)后GSC的干性基因Olig2和Bmi1表達分別上調(diào)4.5倍和2.7倍,Western-blo

5、t實驗證實上述基因在蛋白水平表達也有明顯上調(diào)。
　　2.Hedgehog信號通路是介導(dǎo)內(nèi)皮細胞上述作用的重要通路。
　　2.1PCR與Western-blo實驗證實,與對照組相比,與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)后GSC及GL261細胞內(nèi)的HH信號通路明顯激活,Gli1表達明顯上調(diào)。
　　2.2RNAi敲低GSC的Smo基因表達,Western-blot檢測對GSC的HH通路活性影響,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,HH通路活性受到顯著抑制,Gli

6、1表達明顯降低。
　　2.3敲低GSC的Smo基因表達后,體外成球?qū)嶒炞C實,與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)的GSC體外成球大小顯著小于Smo未敲低組。
　　2.4Western-blot實驗證實,與對照組相比,與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)后的GL261細胞其干性基因表達上調(diào),敲低Smo基因后可明顯抑制上述作用。
　　2.5小鼠移植瘤實驗證實,敲低Smo基因表達可抑制內(nèi)皮細胞對GL261細胞移植瘤的成瘤能力的促進作用。
　　3.Bmi1基因

7、在內(nèi)皮細胞促膠質(zhì)瘤細胞干性表型中起到一定作用。
　　3.1內(nèi)皮細胞促進GL261細胞干性表型時其Bmi1表達上調(diào)。
　　3.2RNAi技術(shù)敲低GL261的Bmi1表達后CD133陽性比例降低(0.78%VS0.05%)。
　　3.3體外成球?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn),敲低GL261細胞Bmi1基因表達后成球體積變小。
　　4.GSC有增強內(nèi)皮細胞的增殖和遷移能力的作用。
　　4.1CCK-8增殖實驗發(fā)現(xiàn),與GSC共培養(yǎng)后,內(nèi)

8、皮細胞孔450nm吸光度(0.044,0.072,0.10)在24h、48h、72h均強于對照組(0.033,0.046,0.064)。
　　4.2與對照組相比,劃痕實驗發(fā)現(xiàn)與GSC共培養(yǎng)后的內(nèi)皮細胞在24h時愈合的速度快于對照組(270μmVS160μm)。Transwell遷移實驗發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)過的內(nèi)皮細胞在24h時遷移至小室下層的細胞數(shù)增多(260個/視野VS150個/視野)。
　　5.GSC促內(nèi)皮細胞的增殖和遷移的作用與

9、HH信號通路的激活有關(guān)。
　　5.1PCR實驗證實,與對照組相比,與GSC共培養(yǎng)后內(nèi)皮細胞的Gli1基因表達上調(diào)9.5倍,Western-blot實驗證實了蛋白水平表達明顯提高,提示與GSC共培養(yǎng)后內(nèi)皮細胞HH信號通路激活。
　　5.2RNAi技術(shù)敲低內(nèi)皮細胞Smo基因表達后,cck-8增殖實驗發(fā)現(xiàn)其72h的吸光度和對照組相比有明顯降低(0.027VS0.020)。
　　5.3.RNAi技術(shù)敲低內(nèi)皮細胞Smo基因表達后

10、,劃痕實驗表明,其遷移能力在8h時(84μmVS53μm)和24h時(173μmVS120μm)均比對照組顯著降低。Transwell遷移實驗發(fā)現(xiàn)其遷移能力在8h(65個/視野VS22個/視野)和24h(244個/視野VS150個/視野)也均明顯降低。
　　6.內(nèi)皮細胞分泌的Shh蛋白在介導(dǎo)Hedgehog通路激活中起重要作用。
　　6.1PCR實驗發(fā)現(xiàn),與對照組相比,共培養(yǎng)體系中GSC和內(nèi)皮細胞內(nèi)Shh基因表達均有上調(diào)(3

11、.8倍,2.0倍)。ELISA實驗發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)體系的培養(yǎng)上清液中Shh、Hhip濃度均增加。
　　6.2PCR實驗發(fā)現(xiàn),共培養(yǎng)時若敲低GSC的Shh基因則對GSC的Gli1基因上調(diào)無影響,若敲低內(nèi)皮細胞Shh基因則GSC的Gli1上調(diào)幅度顯著降低,提示內(nèi)皮細胞的Shh在激活GSC的HH通路中起到更重要的作用。
　　結(jié)論:
　　1.內(nèi)皮細胞可通過激活hedgehog通路促進GSC和膠質(zhì)瘤細胞的干性特征的表達。
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