毛囊干細(xì)胞的多分化潛能及其向汗腺細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、干細(xì)胞(stem cells)維持著生命體組織器官的發(fā)生發(fā)展以及損傷的修復(fù)與再生，隨著近年來再生醫(yī)學(xué)的迅猛發(fā)展，干細(xì)胞治療在臨床中的應(yīng)用日益廣泛，療效顯著，已成為很多難治性疾病的終極治療手段，干細(xì)胞的研究已經(jīng)成為全國乃至全世界的研究熱點(diǎn)。在下文中我們將以毛囊干細(xì)胞這一成體干細(xì)胞為研究主體，對其生物學(xué)特性及其在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)行研究實(shí)驗(yàn)，以期證明毛囊干細(xì)胞為再生醫(yī)學(xué)干細(xì)胞治療的理想干細(xì)胞源。
　　目的:
　　1.體外分離培養(yǎng)

2、并擴(kuò)增毛囊干細(xì)胞(hair follicle stem cells，HFSCs)，建立一種快速高效的細(xì)胞培養(yǎng)體系，為后續(xù)試驗(yàn)奠定基礎(chǔ);
　　2.通過體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，將HFSCs定向誘導(dǎo)為皮脂腺細(xì)胞及表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，驗(yàn)證HFSCs的多分化潛能;
　　3.證實(shí)HFSCs經(jīng)過特殊共培養(yǎng)體系誘導(dǎo)后，可以分化為汗腺樣細(xì)胞(sweatgland cells，SGCs)，并可參與汗腺(sweat gland，SG)的修復(fù)與再生;
　

3、　4.以HFSCs為種子細(xì)胞構(gòu)建結(jié)構(gòu)和功能更趨于完整的組織工程全層皮膚。
　　方法:
　　1.分別用“酶消化-毛囊剝離-直接種植法”及“酶消化-毛囊剝離-酶消化”兩種方法體外分離HFSCs，并將毛囊組織或細(xì)胞植入鋪有Ⅳ型膠原，以絲裂霉素C處理過的成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)層的transwell雙層細(xì)胞培養(yǎng)板中，觀察對比兩組中細(xì)胞的形態(tài)、生長特性、及體外擴(kuò)增能力的異同，并通過CD200、CD29、CK15等HFSCs特異性標(biāo)記物的免疫細(xì)

4、胞化學(xué)染色、免疫細(xì)胞熒光染色及流式細(xì)胞技術(shù)，分析、鑒定分離培養(yǎng)的HFSCs;
　　2.分別建立兩種不同的體外細(xì)胞誘導(dǎo)體系，將HFSCs分別誘導(dǎo)分化為皮脂腺細(xì)胞、表皮細(xì)胞，并通過皮脂腺細(xì)胞及表皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物的免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫細(xì)胞熒光染色及脂質(zhì)的油紅O染色，對誘導(dǎo)后細(xì)胞進(jìn)行表型分析與鑒定;
　　3.體外分離培養(yǎng)人手掌或腳掌來源的SGCs及真皮間充質(zhì)干細(xì)胞(dermalmesenchymal stem cells，d-MSC

5、s)，利用transwell細(xì)胞培養(yǎng)板建立了一種特殊的HFSCs共培養(yǎng)體系，主要由熱休克的SGCs及一種仿真皮結(jié)構(gòu)的間質(zhì)組織構(gòu)成，我們又稱之為間質(zhì)飼養(yǎng)層(mesenchymal feeder layer，M-FL)主要包括:d-MSCs、Matrigel基質(zhì)膠以及一定比例的優(yōu)質(zhì)胎牛血清(FBS)，同時(shí)設(shè)立兩個(gè)對照組，對照組l中不包含熱休克SGCs，對照組2中不包含M-FL;細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)后，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)，免疫細(xì)胞熒光染色及流式細(xì)胞技術(shù)

6、對誘導(dǎo)后細(xì)胞進(jìn)行SGCs表型鑒定，對比實(shí)驗(yàn)組、對照組1、對照組2中細(xì)胞的表型變化情況，同時(shí)，通過臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)觀察各組細(xì)胞的生長活性，Edu(5'-ethynyl-2'-deoxyuridine)標(biāo)記技術(shù)對比分析各組中細(xì)胞的增殖能力;
　　4.體外建立裸鼠腳掌燙傷模型，將HFSCs誘導(dǎo)來源的汗腺樣細(xì)胞（induced-sweat gland cells，i-SGCs）移植到裸鼠腳掌的燙傷部觀察，并以等量Nacl注射作為對照組，4周

7、后，愈合創(chuàng)面全層皮膚取材，汗腺特異性標(biāo)記物癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)、細(xì)胞角蛋白14(cytokeratin14，CK14)的免疫組化及免疫熒光染色分析判斷，觀察接受細(xì)胞移植的創(chuàng)面皮膚中是否有新生的汗腺結(jié)構(gòu)存在;
　　5.蛋白印跡法(western bolt)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR

8、)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescentquantitative PCR)檢測分析HFSCs誘導(dǎo)前、后的外胚層發(fā)育不良(ectodermaldysplasia，EDA)基因及其受體（ectodermal dysplasia receptor, EDAR）的基因及蛋白表達(dá)的變化，以進(jìn)一步探索HFSCs分化為SGCs的分子機(jī)制;
　　6.分別以HFSCs（A組），表皮干細(xì)胞(epidermal stem ce

9、lls，ESCs)(B組)為種子細(xì)胞體外建立組織工程學(xué)全層皮膚，通過伊紅-蘇木素(hematoxylin-eosinstaining，HE)染色分析兩組標(biāo)本形態(tài)結(jié)構(gòu)的異同，觀察A組標(biāo)本中是否有毛囊樣結(jié)構(gòu)形成;兩組標(biāo)本分別進(jìn)行integrinβ1(CD29)、細(xì)胞角蛋白19(cytokeratin19，CK19)免疫組織化學(xué)染色，觀察陽性細(xì)胞分布多少及分布區(qū)域。
　　結(jié)果:
　　1.“酶消化-毛囊剝離-直接種植法”及“酶消化-

10、毛囊剝離-酶消化”兩種細(xì)胞分離方法對比結(jié)果顯示:應(yīng)用前一種方法培養(yǎng)的第一代細(xì)胞生長至80-90％融合的時(shí)間為13～14天，而后一種方法為8～9天，但是傳代后，從第二代細(xì)胞開始，兩組細(xì)胞的生長速度及增殖能力無明顯差異，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05);
　　2.經(jīng)過特異性微環(huán)境的誘導(dǎo)，HFSCs分別被誘導(dǎo)分化為上皮膜抗原(EMA)及油紅染色陽性的皮脂腺細(xì)胞，以及細(xì)胞角蛋白10(cytokeratin10，CK10)陽性的角質(zhì)形成細(xì)胞;<

11、br>　　3.在HFSCs汗腺化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組中，有一部分HFSCs最終被定向誘導(dǎo)分化成為具有汗腺表型的細(xì)胞，對比之下，對照組1中沒有細(xì)胞分化為SGCs.對照組2中只有極少部分細(xì)胞發(fā)生了向SGCs的轉(zhuǎn)化;我們利用細(xì)胞的特異性標(biāo)記物，通過免疫熒光染色及流式細(xì)胞技術(shù)鑒定誘導(dǎo)后細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在這些細(xì)胞中HFSCs特異性標(biāo)記物CD200、CD29及CK15的表達(dá)變?nèi)趿耍瓜偌?xì)胞特異性標(biāo)記物CEA和CK14的表達(dá)卻增強(qiáng)了，這說明HFSCs在設(shè)計(jì)

12、的共培養(yǎng)微環(huán)境中可以實(shí)現(xiàn)向SGCs的分化;
　　4.western blot結(jié)果顯示分化而來的SGCs高表達(dá)EDA和EDAR，RT-PCR及實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析顯示EDA基因及EDAR基因在誘導(dǎo)后SGCs中呈高表達(dá)狀態(tài);而CD29、CD200等HFSCs特異性抗原基因在汗腺化誘導(dǎo)后表達(dá)降低;
　　5.在隨后的細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)中，接受了細(xì)胞注射的裸鼠燙傷腳掌的愈合創(chuàng)面，我們發(fā)現(xiàn)了類似SG的新生結(jié)構(gòu)，進(jìn)而行SGCs特異性標(biāo)記物的免

13、疫組織化學(xué)染色及免疫熒光染色，結(jié)果顯示這些類似汗腺的結(jié)構(gòu)對CEA、CK14呈陽性表達(dá)，而在Nacl注射組的創(chuàng)面標(biāo)本中，沒有發(fā)現(xiàn)這種類汗腺結(jié)構(gòu)的存在。
　　6.在以HFSCs為種子細(xì)胞的A組及以ESCs為種子細(xì)胞的B組標(biāo)本中，HE染色結(jié)果顯示，兩組標(biāo)本均由表皮和真皮組成，二者之間以基底層相連接，基底層細(xì)胞排列較為整齊，細(xì)胞偏大，有CK19+和CD29+細(xì)胞散在分布;兩組間標(biāo)本對比顯示:A組標(biāo)本中，表皮層相對于B組較厚，分層較多，而且

14、部分標(biāo)本在基底層下方有毛囊樣結(jié)構(gòu)形成，表皮與真皮結(jié)合較緊密;B組標(biāo)本對比A組來說，表皮層較薄，分層較少，表皮真皮易分離，基底層附近CK19+和CD29+陽性細(xì)胞較A組標(biāo)本少，基底層下淺真皮層中無毛囊樣結(jié)構(gòu)形成。
　　結(jié)論:
　　1.HFSCs可以在體外適宜的微環(huán)境中被分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增;其中“酶消化-毛囊剝離-酶消化”法較“酶消化-毛囊剝離-直接種植”法縮短了原代細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間，在實(shí)驗(yàn)中更具優(yōu)勢;
　　2.HFSCs具有

15、多分化潛能，可以在體外被誘導(dǎo)分化為皮脂腺細(xì)胞及表皮角質(zhì)形成細(xì)胞;
　　3.HFSCs可以在適宜的微環(huán)境中，被誘導(dǎo)分化為SGCs; HFSCs作為一種成體干細(xì)胞，有用于治療汗腺缺失的潛能;我們建立的共培養(yǎng)誘導(dǎo)體系可以有效的將HFSCs定向誘導(dǎo)分化為SGCs，其分子機(jī)制與EDA/EDAR基因的激活有關(guān);誘導(dǎo)分化而來的汗腺細(xì)胞是有功能的，可以參與皮膚創(chuàng)面中汗腺的再生;
　　4.以HFSCs為種子細(xì)胞有望構(gòu)建出富含皮膚附屬器的，形態(tài)