肝臟干細(xì)胞向胰腺β細(xì)胞分化的研究.pdf

1、目前，糖尿病已成為嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一。根據(jù)胰島素分泌的絕對(duì)和相對(duì)不足可分為Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病，其中Ⅰ型糖尿病的發(fā)病本質(zhì)是產(chǎn)生胰島素的胰島β細(xì)胞被破壞所致。雖然臨床上通過給患者服用降糖藥或注射胰島素可將患者的血糖控制在正常范圍內(nèi)，但這些治療措施不能有效預(yù)防糖尿病所致的各種晚期并發(fā)癥。近年來，胰腺或胰島細(xì)胞移植被認(rèn)為是根治糖尿病的最好療法，但移植后的免疫排斥反應(yīng)和供體的嚴(yán)重缺乏等問題限制了該療法的實(shí)際應(yīng)用。如今，隨著對(duì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分

2、化和成體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化研究的深入，通過誘導(dǎo)分化或轉(zhuǎn)分化獲得可用于移植的胰島素分泌細(xì)胞己成為糖尿病治療研究的一個(gè)新的熱點(diǎn)。 研究表明通過強(qiáng)制表達(dá)某些組織特異性轉(zhuǎn)錄因子，可使一種組織類型的細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為另一種組織類型的細(xì)胞。在個(gè)體發(fā)育過程中，肝臟和胰腺都起源于前腸末端，發(fā)育上的同源性提示肝臟和胰腺在細(xì)胞增殖和分化調(diào)控等方面有很高的相似性。因此，人們推測(cè)肝臟來源的細(xì)胞可能會(huì)更容易的轉(zhuǎn)分化為胰腺β細(xì)胞。目前已有證據(jù)表明，有些胰腺發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄

3、因子(如Pdx1、NeuroD、Pax4、MafA等)可將肝原始細(xì)胞、成熟的肝細(xì)胞，甚至肝腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化為可分泌胰島素的胰腺β細(xì)胞樣細(xì)胞。這些研究成果一方面有望緩解糖尿病細(xì)胞治療的細(xì)胞來源問題，另一方面也為糖尿病治療提供了一個(gè)新的思路：即可在體內(nèi)利用患者的肝干細(xì)胞或肝細(xì)胞的胰向分化來實(shí)現(xiàn)治療目的。 然而，目前人們還沒有建立高效的、特異的誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的技術(shù)體系。為此，本研究通過PCR的方法成功克隆了人胰腺轉(zhuǎn)

4、錄因子Pdx1、Pax4、NeuroD和MafA基因，并將其插入到pAd-track-CMV穿梭載體中，然后在AdEasier-1細(xì)胞中重組產(chǎn)生重組腺病毒質(zhì)粒，繼而在293LP細(xì)胞中包裝出感染性重組腺病毒。重組腺病毒以復(fù)合感染(multiplicity of infection，M．O．I)指數(shù)為20感染人胎肝干細(xì)胞(human fetal liver stem cells，hFLSCs)，24小時(shí)后，熒光顯微鏡下觀察顯示幾乎所有的細(xì)胞

5、都表達(dá)報(bào)告基因GFP，RT-PCR和Western Blot檢測(cè)顯示外源基因在人胎肝干細(xì)胞中可轉(zhuǎn)錄和翻譯。進(jìn)一步將重組腺病毒懸液經(jīng)尾靜脈注入小鼠體內(nèi)6天后，小鼠肝臟幾乎所有的細(xì)胞都表達(dá)了GFP報(bào)告基因。這些結(jié)果表明，本研究已成功構(gòu)建了胰腺轉(zhuǎn)錄因子Pdx1、Pax4、NeuroD、MafA的腺病毒表達(dá)載體，這為肝干細(xì)胞向胰腺β細(xì)胞分化或在小鼠肝臟中建立分泌胰島素的細(xì)胞群的研究準(zhǔn)備了條件。在此基礎(chǔ)上，為了建立肝干細(xì)胞高效特異的向胰腺β細(xì)胞轉(zhuǎn)