人臍帶間充質(zhì)干細胞向汗腺細胞誘導(dǎo)分化及向裸鼠移植的研究.pdf

1、目的:人臍帶間充質(zhì)干細胞(UC-MSCs)具有向多種成熟細胞分化的潛能，如成軟骨細胞、成骨細胞、神經(jīng)細胞及成脂肪細胞等，其分離、培養(yǎng)較為容易，純度高，且來源豐富，可在體外多次擴增，異體移植免疫排斥風險小。由于UC-MSCs具有以上的優(yōu)點，使其逐漸被研究者所關(guān)注，尤其是在組織的修復(fù)方面，可以將其應(yīng)用于器官、組織的修復(fù)及重建。本實驗通過研究人臍帶間充質(zhì)干細胞分離，在不同條件下的培養(yǎng)及鑒定，得出培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞的最優(yōu)培養(yǎng)條件。并進一步通

2、過間接共培養(yǎng)的誘導(dǎo)方式使其向汗腺細胞定向誘導(dǎo)分化，將誘導(dǎo)后的UC-MSCs用BrdU進行標定，移植入裸鼠皮膚，觀察其在裸鼠體內(nèi)的存活及分布狀況。
　　 方法:
　　 1、UC-MSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定:獲得無菌足月剖宮產(chǎn)健康胎兒臍帶，剪刀將其剪成3-4cm長短的臍帶組織段，生理鹽水反復(fù)沖洗，去除殘留的血液，剪刀將其剪開后鑷子剔除臍帶中的兩條臍動脈、一條臍靜脈，以免被血管內(nèi)皮細胞所污染。用鑷子將臍帶中的沃頓膠組織(Wha

3、rton'sJelly)呈條索狀撕裂下來，剪刀剪成大小約1mm3的沃頓膠組織塊，置于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。當細胞長滿瓶底后，0.25％胰酶消化貼壁細胞，進行傳代。流式細胞術(shù)檢測培養(yǎng)細胞的表面抗原表達情況。
　　 2、UC-MSCs生長的影響因素及生長曲線的繪制:用MTT比色法分別檢測不同胎牛血清濃度在490nm處吸光度值的均數(shù)(OD值)。同樣用MTT比色法分別檢測當種植密度不同時在490nm處吸光度值的均數(shù)(OD值)。觀察傳代后不同時期

4、UC-MSCs的生長情況，繪制生長曲線。
　　 3、汗腺細胞(h-SGCs)培養(yǎng):將所取正常全層皮膚，去除皮下脂肪后，剪成1mm3大小組織塊，用Ⅱ型膠原酶消化法獲得汗腺組織，培養(yǎng)汗腺細胞(h-SGCs)貼壁生長;大部分汗腺團塊貼壁后，進行換液，此后3-4天換液一次。對培養(yǎng)細胞進行免疫組化檢測CEA和CK7表面抗原的表達情況。
　　 4、UC-MSCs誘導(dǎo)分化及鑒定:將培養(yǎng)的汗腺細胞進行47℃水浴造成體外熱休克，通過傳三代

5、(p3)UC-MSCs間接共培養(yǎng)誘導(dǎo)UC-MSCs分化為有汗腺表型的干細胞，免疫組化法檢測CEA和CK7表面抗原的表達情況。
　　 5、對誘導(dǎo)后干細胞進行核型分析:將誘導(dǎo)后細胞加入秋水仙素0.2mg/L一滴，低滲固定消化等處理，進行細胞染色體檢測。
　　 6、BrdU轉(zhuǎn)染及鑒定:在傳3代(p3)UC-MSCs中加入BrdU抗原40μg/ml用來標記培養(yǎng)基，48h后，可見UC-MSCs生長良好，懸浮細胞少，鋪片用免疫組化法

6、檢測轉(zhuǎn)染情況。
　　 7、將誘導(dǎo)分化后的細胞進行裸鼠移植:將誘導(dǎo)分化后的UC-MSCs進行BrdU標定，與人脫細胞異體真皮共同覆蓋在裸鼠缺損皮膚創(chuàng)面上，覆蓋異體裸鼠皮片，打包固定。2周后將包與縫線拆除，1個月后取活檢，進行HE及免疫組化檢測。移植后連續(xù)觀察實驗鼠3個月。
　　 結(jié)果:
　　 1、UC-MSCs分離、培養(yǎng)、鑒定:培養(yǎng)3-5d后，已有少量臍帶組織塊周圍爬出成纖維樣細胞。一周后，可見部分組織塊周圍爬出成

7、纖維樣細胞，給予換液。之后2-3天給予換液一次，傳1、2代(p1、P2)的UC-MSCs呈長梭行，形態(tài)均一。培養(yǎng)至傳八代細胞(P8)，UC-MSCs仍然存活，但生長緩慢，形態(tài)開始發(fā)生變化，折光性變得較差，部分細胞已開始脫壁凋亡。對分離培養(yǎng)的UC-MSCs進行流式細胞術(shù)檢測，干細胞表面標志物CD29、CD44、CD105表達率較高，造血干細胞表面標志物CD14、CD34、CD45幾乎不表達，提示本實驗培養(yǎng)得到的細胞為較純化的MSCs。

8、r>　　 2、UC-MSCs生長的影響因素及生長曲線的繪制:當胎牛血清濃度為10％時MTT比色法檢測OD490值最高，細胞活性好，活細胞數(shù)量較多。當種植密度為105/ml時MTT比色法檢測OD490值最高，細胞活性好，活細胞數(shù)量較多。繪制的細胞生長曲線包括滯留期、生長對數(shù)期、平臺期。
　　 3、汗腺細胞(h-SGCs)培養(yǎng):培養(yǎng)3天后，已有汗腺貼壁，鏡下可見汗腺團塊周圍爬出不規(guī)則形細胞，呈集落狀生長;培養(yǎng)7天后，大部分汗腺團塊

9、貼壁，給予換液;12天后，鏡下可見汗腺團塊周圍爬滿不規(guī)則細胞，呈鋪路石樣生長。
　　 4、UC-MSCs誘導(dǎo)分化及鑒定:將誘導(dǎo)分化后的細胞進行免疫組化檢測細胞特異抗原，CEA和CK7包漿染色均為紅棕色，為陽性。
　　 5、對誘導(dǎo)后干細胞進行核型分析:鏡下隨機觀察30個細胞的染色體，計數(shù)染色體條數(shù)，結(jié)果染色體數(shù)均為46條，均未見染色體變異。
　　 6、BrdU轉(zhuǎn)染及鑒定:免疫組化檢測結(jié)果可見部分細胞核呈棕黃色。

10、r>　　 7、將誘導(dǎo)分化后的細胞進行裸鼠移植:HE染色可見脫細胞異體真皮中細胞均勻分布。免疫組化檢測BrdU抗原表達情況，可見BrdU標定的誘導(dǎo)后干細胞均勻分布在人脫細胞異體真皮中。
　　 結(jié)論:
　　 本實驗通過研究人臍帶間充質(zhì)干細胞分離，在不同條件下的培養(yǎng)、誘導(dǎo)及鑒定，得出培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞的最優(yōu)培養(yǎng)條件。并進一步通過間接共培養(yǎng)的誘導(dǎo)方式使其向汗腺細胞分化，將誘導(dǎo)后的UC-MSCs用BrdU進行標定，移植入裸鼠

11、皮膚，觀察其在裸鼠體內(nèi)的存活及分布狀況，得到以下結(jié)論:
　　 1、流式細胞術(shù)檢測培養(yǎng)細胞的表面標志物CD29、CD44、CD105表達率較高，造血干細胞表面標志物CD14、CD34、CD45幾乎不表達，提示本實驗培養(yǎng)得到的細胞較純，可以用于實驗研究。
　　 2、實驗中我們發(fā)現(xiàn)最適宜UC-MSCs生長的環(huán)境為含10％胎牛血清和90％DMEM(L)的培養(yǎng)液，最適宜UC-MSCs生長的種植密度為105/ml。UC-MSCs生長

12、呈現(xiàn)先慢后快再慢的S型曲線，實驗中我們可以發(fā)現(xiàn)P3以內(nèi)的UC-MSCs形態(tài)穩(wěn)定、適應(yīng)性強、代謝旺盛，可用于后續(xù)實驗研究。
　　 3、經(jīng)鑒定，誘導(dǎo)后干細胞免疫組化檢測CEA和CK7表面抗原均為陽性，提示誘導(dǎo)后干細胞已具備汗腺細胞表型。
　　 4、染色體檢測結(jié)果顯示，此間接共培養(yǎng)誘導(dǎo)方式對染色體核型無明顯變化，為安全、可靠誘導(dǎo)方式。
　　 5、經(jīng)檢測，BrdU轉(zhuǎn)染為成功的。
　　 6、動物實驗證實:誘導(dǎo)分化后