水牛生精上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的初步研究.pdf

1、為建立水牛精原細(xì)胞增殖及分化的培養(yǎng)體系，本研究以本地水牛睪丸為材料，進(jìn)行了如下研究： (1)探討了水牛曲精細(xì)管發(fā)育過程中的細(xì)胞類型變化規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水牛出生后曲精細(xì)管的直徑逐漸增大，由初生時(shí)的37.5～50.0μm增大到10～12月齡的125.0～150.0μm，生精細(xì)胞由初生時(shí)的單一性原細(xì)胞逐步分化形成精原細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子，其中3～5月齡水牛曲精細(xì)管的直徑約為75.0～87.5μm，生精細(xì)胞主要為精原細(xì)胞，是研究精原細(xì)胞

2、分離培養(yǎng)的最佳材料。 (2)探討了水牛睪丸支持細(xì)胞的分離、純化培養(yǎng)方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3～5月齡水牛睪丸組織采用膠原酶、胰蛋白酶兩步法消化后，平均每克組織得到2.61×106個(gè)細(xì)胞，平均活率為89.37％；用差異黏附法和高溫培養(yǎng)法(38.5℃培養(yǎng)24h)純化后，支持細(xì)胞純度達(dá)90％以上；RT-PCR檢測(cè)及測(cè)序發(fā)現(xiàn)，支持細(xì)胞表達(dá)GATA4，GDNF，而精原細(xì)胞表達(dá)GBNF受體。 (3)探討了水牛精原細(xì)胞的分離、純化及培養(yǎng)方法。

3、結(jié)果發(fā)現(xiàn)，曲精細(xì)管片段培養(yǎng)極容易漂浮，而組合酶消化后再培養(yǎng)，所得精原細(xì)胞較多；Pereoll純化后精原細(xì)胞純度可達(dá)62.95％；AKP染色顯示，支持細(xì)胞呈陰性，管周樣細(xì)胞和未分化的精原細(xì)胞呈陽性，分化的精原細(xì)胞表達(dá)C-Kit；精原細(xì)胞培養(yǎng)4wk后出現(xiàn)單倍體精子細(xì)胞，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)證實(shí)，獲得單倍體精子細(xì)胞特有的基因PRM-2。 以上結(jié)果表明，(1)隨著水牛睪丸曲精細(xì)管的發(fā)育，其細(xì)胞組合類型發(fā)生明顯改變，3～5月齡水牛的睪丸曲精