口腔黏膜上皮細胞體外培養(yǎng)與溫度敏感性支架材料研制的實驗研究.pdf

1、作為一種來源充足、具有良好生理學活性、能有效避免排斥反應的角膜替代物,組織工程角膜已成功地應用于多種損傷修復,其中角膜上皮的構建對于角膜緣干細胞缺乏患者的治療具有指導意義。支架材料的應用與種子細胞的選擇對于組織工程技術至關重要,如何利用組織工程技術構建具有良好生物學活性、發(fā)揮正常生理功能的組織工程角膜,具有重要的探索價值與臨床實際應用意義。支架材料是細胞增殖的場所,同時引導細胞生長,決定著所構建組織的形態(tài)。隨著組織工程學的不斷發(fā)展,人工

2、合成智能高分子材料在生物醫(yī)學中的應用已越來越廣泛。聚N-異丙基丙烯酰胺是一種快速溫度敏感型智能高分子,由于其對外界微小溫度刺激能引起微觀結構迅速而可逆的變化,使得上皮層與材料層之間得以順利脫離,因而避免了移植后材料的生物降解問題,形成了“無載體”的支架材料?？谇火つと〔姆奖?來源豐富,而且口腔黏膜上皮中廣泛分布著干細胞,體外擴增能力較強,因此,利用口腔黏膜上皮細胞作為種子細胞進行眼表重建成為研究熱點。
　　本研究分為兩部分:第一部

3、分擬應用聚N-異丙基丙烯酰胺接枝于聚苯乙烯膜,制備具有溫度敏感性的支架材料,了解其生物學性能;第二部分擬利用兔口腔黏膜上皮細胞進行體外培養(yǎng),了解其擴增規(guī)律。為進一步利用口腔黏膜上皮細胞為種子細胞,溫度敏感性材料為支架材料,修復角膜上皮缺損奠定基礎,為臨床上治療角膜緣干細胞缺損的患者提供新的思路。
　　第一部分：溫度敏感性支架材料的研制
　　[目的]：通過研制溫度敏感性高分子共聚膜,了解其化學特性,為進一步應用“無載體”支架材

4、料進行細胞培養(yǎng)奠定基礎。
　　[方法]：以電子束為輻射源,將N-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)接枝到聚苯乙烯(PS)膜上,制得PS-g-NIPAAm二元共聚物。通過稱重測定聚合反應的接枝率:以紅外光譜儀測定共聚物的化學組成;以接觸角測量儀測定共聚物的親/疏水性;以差熱分析儀測定共聚物的相轉變溫度(LCST);測定不同環(huán)境溫度下(25～45℃)共聚物膜的溶脹比,得到其脫溶脹和再溶脹的動力學曲線,明確共聚物膜的溶脹性能;以電子顯微鏡觀

5、察聚合膜的超微結構。
　　[結果]：PS-g-NIPAAm共聚物膜接枝率為39.2％,紅外光譜儀測定發(fā)現(xiàn)約1650cm-1處出現(xiàn)氨基與羰基的重疊峰,均證明NIPAAm已接枝在PS膜上。共聚物膜的接觸角為46.9°,證明疏水的PS膜接枝NIPAAm后具有親水性。共聚物的LCST為35℃左右,在LCST以下溶脹,其溶脹率比可高達干膜的十倍左右,在LCST以上發(fā)生脫溶脹而收縮,變得幾乎與干膜一樣。電子顯微鏡下,NIPAAm廣泛分布于PS

6、膜上。
　　[結論]：PS-g-NIPAAm共聚膜具有良好的溫度敏感性與溶脹性能,為“無載體”支架材料的應用提供理論依據(jù)。
　　第二部分：口腔黏膜上皮細胞的體外培養(yǎng)
　　[目的]：通過體外培養(yǎng)兔口腔黏膜上皮細胞,掌握其擴增規(guī)律,為進一步利用口腔黏膜上皮細胞為種子細胞重建角膜上皮奠定基礎。
　　[方法]：取新西蘭白兔口腔黏膜組織小塊,用Dispase分離后經(jīng)胰酶-EDTA消化成單細胞懸液,接種后靜置培養(yǎng),定期換液。

7、以相差顯微鏡每日動態(tài)觀察細胞形態(tài)變化及生長增殖情況,行常規(guī)組化染色,并通過透射電鏡,觀察其超微結構。測定細胞生長曲線及克隆形成率,了解細胞生長基本規(guī)律及其增殖能力。
　　[結果]：生長良好的口腔黏膜上皮細胞為卵圓形,細胞連接成片呈鋪路石狀,胞核較大,無異常核分裂相。透射電鏡下,上皮細胞核大呈圓形或卵圓形,胞質內可見正常細胞器,胞漿內含大量的張力纖維,呈網(wǎng)狀或束狀排列,細胞表面有許多微絨毛。細胞接種后第1～4天為靜止生長期,第6～1