利用脫細胞豬角膜基質(zhì)膜片構(gòu)建組織工程化兔角膜基質(zhì).pdf

1、目的: 探討氯化鈉法及冰凍切片法制備脫細胞豬角膜基質(zhì)膜片的可行性，并進一步復(fù)合兔角膜基質(zhì)細胞構(gòu)建組織工程角膜基質(zhì)，探討脫細胞角膜基質(zhì)膜片在兔角膜基質(zhì)缺損中的修復(fù)效果，為角膜基質(zhì)的組織工程修復(fù)治療提供實驗依據(jù)。
　　方法: 將去除上皮層和內(nèi)皮層的全層豬角膜基質(zhì)瓣采用氯化鈉法脫細胞，組織學檢測脫細胞效率，冰凍切片法將脫凈細胞的厚基質(zhì)瓣切成20μm厚度的脫細胞角膜基質(zhì)膜片，紫外線照射滅菌保存。采用組織塊法分離培養(yǎng)兔角膜基質(zhì)細胞，傳至第三

2、代作為構(gòu)建組織工程角膜基質(zhì)的種子細胞。將培養(yǎng)的兔角膜基質(zhì)細胞以三明治法接種于脫細胞角膜基質(zhì)膜片支架，層層疊加6層膜片形成支架-細胞復(fù)合物，體外培養(yǎng)2周后組織學檢測組織形成狀態(tài)。構(gòu)建兔角膜基質(zhì)缺損模型，將膜片和基質(zhì)細胞按照三明治法移植至角膜基質(zhì)缺損部位，共疊加5層膜片，另設(shè)單純?nèi)睋p不修復(fù)組、厚基質(zhì)移植組(100μm)、單純膜片無細胞組（5層）為對照組，術(shù)后第1月，3月和6月進行大體拍照觀察、眼前節(jié)光學相干斷層掃描、超聲角膜測厚、角膜透光度

3、檢測、生物力學檢測、組織學檢查、透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察等，評價治療效果。
　　結(jié)果: 氯化鈉法能有效脫除豬角膜基質(zhì)中的角膜基質(zhì)細胞，同時能良好地維持基質(zhì)膠原纖維的形態(tài)和排列，在脫細胞基質(zhì)的基礎(chǔ)上制作脫細胞基質(zhì)膜片簡單易行。組織塊法培養(yǎng)的兔角膜基質(zhì)細胞體外生長良好，細胞接種至脫細胞豬角膜基質(zhì)膜片支架材料上增殖良好，掃描電鏡檢測顯示細胞在膜片上貼附生長良好。體外構(gòu)建組織分層明顯，細胞存活但基質(zhì)分泌少。兔角膜基質(zhì)移植修復(fù)實驗中，單純?nèi)睋p不

4、修復(fù)組角膜菲薄，局部白色瘢痕及新生血管長入;厚基質(zhì)移植組透明度尚可，瞳孔區(qū)可見云翳，隨時間的延長云翳略減淡;單純膜片無細胞組無明顯瘢痕，但可見少量膜片皺褶，角膜欠透明，呈斑翳形態(tài);脫細胞基質(zhì)膜片接種角膜細胞組3個月時可見縫線周圍新生血管生成，6個月時逐漸減退，角膜透明。眼前節(jié)光學相干斷層掃描顯示單純?nèi)睋p組基質(zhì)信號不均，有高信號區(qū)的疤痕組織;厚膜片組可見移植膜片與原基質(zhì)間有明顯的界限，融合欠佳;單純膜片組角膜基質(zhì)層信號欠均勻，可見裂隙狀低

5、信號區(qū)，表明膜片間粘合欠佳;膜片加細胞組基質(zhì)信號較均勻，移植膜片間融合良好。厚度檢測發(fā)現(xiàn)單純?nèi)睋p組最薄，其次為單純脫細胞基質(zhì)膜片移植組，脫細胞基質(zhì)移植組和膜片加細胞移植組的厚度均與正常組接近。脫細胞基質(zhì)膜片加角膜細胞移植組在各波長可見光下的透光率與正常角膜最為接近。與正常對照組相比，單純?nèi)睋p組的生物力學檢測值均最低，而脫細胞膜片加細胞移植組術(shù)后6個月的最大荷載，抗拉強度和彈性模量均與正常組十分接近。組織學檢查發(fā)現(xiàn)單純?nèi)睋p組的角膜厚度顯著

6、變薄，雖然厚基質(zhì)移植組，及單純基質(zhì)膜片移植組的厚度有所增加，但未見細胞分布，而膜片加細胞移植組見細胞均勻分布。透射電鏡檢測中，膜片加細胞移植組的膠原纖維直徑與正常組無統(tǒng)計學意義的差異。
　　結(jié)論: 氯化鈉法加冰凍切片法制作脫細胞豬角膜基質(zhì)膜片簡單易行。脫細胞豬角膜基質(zhì)膜片用組織塊法培養(yǎng)的兔角膜基質(zhì)細胞在脫細胞豬角膜基質(zhì)膜片支架上生長良好，采用膜片與接種細胞疊加的方法能使角膜基質(zhì)細胞較均勻地分布在基質(zhì)層中，利于新生角膜基質(zhì)的生成和修