Rab蛋白在天然免疫及腫瘤中的功能學(xué)研究.pdf

1、細(xì)胞的生命活動(dòng)得以實(shí)現(xiàn)依賴于生物膜體系，通過(guò)膜的動(dòng)態(tài)變化從而調(diào)控能量轉(zhuǎn)換、信號(hào)識(shí)別以及物質(zhì)運(yùn)輸?shù)然镜纳^(guò)程。目前研究表明。有多個(gè)蛋白家族參與細(xì)胞膜的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，包括?？扇苄訬SF粘附蛋白受體蛋白(SNARE)、衣殼蛋白(Coats)、銜接蛋白(Tethers)、動(dòng)力蛋白(Motor)和Rab蛋白。其中Rab蛋白作為一個(gè)組織和維持細(xì)胞內(nèi)膜動(dòng)態(tài)變化的核心成員，在細(xì)胞內(nèi)的囊泡形成及轉(zhuǎn)運(yùn)等各個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮了重要作用。目前已知的哺乳細(xì)胞內(nèi)有超過(guò)70

2、個(gè)Rab蛋白。通過(guò)各自的特異性的GTPase結(jié)構(gòu)域從而高度定位在專屬囊泡的膜表面，發(fā)揮囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的時(shí)空調(diào)節(jié)。在鳥(niǎo)苷酸交換因子(GDP/GTP exchange factor, GEF)的作用下，GTP替代Rab蛋白結(jié)構(gòu)域上的GDP，使得Rab蛋白被激活。激活的Rab蛋白可以插入到待轉(zhuǎn)運(yùn)的細(xì)胞器的膜上，進(jìn)一步募集下游的相互作用蛋白，開(kāi)始發(fā)揮其調(diào)節(jié)囊泡運(yùn)輸?shù)淖饔?。隨著研究的不斷深入，對(duì)Rab蛋白的認(rèn)知也從單純的調(diào)控囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)擴(kuò)展到了天然免疫的調(diào)

3、節(jié)，影響癌癥進(jìn)程等諸多方面。
　　作為一個(gè)調(diào)控免疫反應(yīng)的中心指揮站，樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)通過(guò)精確調(diào)控復(fù)雜的膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)以對(duì)抗病原體和腫瘤的入侵。從外源性抗原的吞噬、降解到MHC的負(fù)載，幾乎所有的抗原呈遞過(guò)程都在內(nèi)吞相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡中進(jìn)行;與此同時(shí)，樹(shù)突狀細(xì)胞通過(guò)識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)或危險(xiǎn)相關(guān)分子模式(danger-as

4、sociated molecular pattern，DAMP)，觸發(fā)了多種胞內(nèi)囊泡表面的炎癥信號(hào)分子，從而分泌細(xì)胞因子或化學(xué)因子完成免疫反應(yīng)的初始化過(guò)程。毫無(wú)疑問(wèn)，Rab蛋白在樹(shù)突狀細(xì)胞免疫調(diào)控的過(guò)程中發(fā)揮了重要的膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)作用。例如。Rab27a可以限制吞噬體的酸化并啟動(dòng)交叉呈遞;傷寒沙門(mén)菌通過(guò)拮抗Rab9而抑制抗原遞呈。因此，描繪樹(shù)突狀細(xì)胞中Rab調(diào)控的轉(zhuǎn)運(yùn)網(wǎng)絡(luò)及機(jī)制將極大促進(jìn)對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞天然防御的認(rèn)知。
　　為了細(xì)致的描繪

5、樹(shù)突狀細(xì)胞中Rab蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)網(wǎng)絡(luò)，我們首先構(gòu)建了51個(gè)穩(wěn)定表達(dá)eXact-6His-Rab融合蛋白的DC2.4細(xì)胞系。通過(guò)發(fā)展了一個(gè)新的串聯(lián)親和純化(Tandem affinity purification，TAP)平臺(tái)，簡(jiǎn)便高效的對(duì)每個(gè)Rab蛋白相互作用蛋白復(fù)合物進(jìn)行純化。通過(guò)液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-electrosprayionization-tandem mass spectrome

6、try，LC-ESI MS)檢測(cè)，最終得到1670個(gè)獨(dú)特的蛋白并和51個(gè)Rab蛋白構(gòu)成8874組相互作用蛋白對(duì)。隨后通過(guò)一個(gè)基于無(wú)偏見(jiàn)的比較指標(biāo)算法(CompPASS)給每一個(gè)相互作用蛋白賦予權(quán)重打分，最終我們獲得373個(gè)獨(dú)特的高可信蛋白（high-confidence interacting proteins，HCIPs）構(gòu)成了649組相互作用蛋白對(duì)。隨后，通過(guò)全面的蛋白質(zhì)組學(xué)分析并輔助于影像學(xué)技術(shù)，我們提出了多個(gè)Rab-Rab之間的

7、亞網(wǎng)絡(luò)功能假說(shuō)。特別的是，通過(guò)研究單核增生李斯特菌（L.monocytogenes）感染前后Rab32相互作用網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)Rab32-Phb-Phb2蛋白復(fù)合物在細(xì)菌的胞內(nèi)增殖過(guò)程中早期吞噬體的形成和細(xì)菌逃逸后的再次捕獲過(guò)程中發(fā)揮重要作用。此外，這三種蛋白在吞噬體向溶酶體過(guò)渡的過(guò)程中也是必不可少的。總之，通過(guò)系統(tǒng)性研究Rab蛋白囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)組織結(jié)構(gòu)，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)Rab32-Phb-Phb2抗微生物的重要性，為今后進(jìn)一步研究Rab蛋白的功