TLR9信號(hào)途徑在成牙本質(zhì)細(xì)胞中作用的研究.pdf

1、齲病是口腔常見(jiàn)病、多發(fā)病。當(dāng)齲壞到達(dá)牙本質(zhì)后，致齲菌和/或其毒性產(chǎn)物可以通過(guò)牙本質(zhì)小管進(jìn)入牙髓腔，導(dǎo)致牙髓炎癥。免疫反應(yīng)和第三期牙本質(zhì)是牙髓發(fā)揮防御和修復(fù)能力的主要方式。成牙本質(zhì)細(xì)胞由于具有長(zhǎng)的細(xì)胞突起深入到牙本質(zhì)小管，是牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體最先接觸細(xì)菌微生物的細(xì)胞，那么成牙本質(zhì)細(xì)胞是否和口腔粘膜上皮細(xì)胞一樣，具有天然免疫的功能，多年來(lái)未見(jiàn)研究報(bào)道。TLR9是特異識(shí)別包含未甲基化CpG基序的細(xì)菌DNA（CpGDNA）的天然免疫受體，在許多組

2、織細(xì)胞均可快速激活天然免疫反應(yīng)，并啟動(dòng)后續(xù)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)，在組織細(xì)胞免疫防御反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用，目前在抗感染、抗過(guò)敏和抗腫瘤治療中已取得了很大的研究進(jìn)展。本課題組發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞表達(dá)TLR9，提示TLR9可能介導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞的天然免疫功能。但是對(duì)于體內(nèi)的成牙本質(zhì)細(xì)胞是否表達(dá)TLR9、TLR9是否特異識(shí)別細(xì)菌DNA、TLR9活化后細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑以及下游基因表達(dá)情況國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　面對(duì)細(xì)菌入侵，除了免疫反應(yīng)

3、，形成第三期牙本質(zhì)是牙髓發(fā)揮防御和修復(fù)能力的另一種主要方式。許多研究證實(shí)DSPP基因表達(dá)產(chǎn)物在牙本質(zhì)形成和礦化，以及第三期牙本質(zhì)形成過(guò)程中均發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。由于在細(xì)菌感染導(dǎo)致成牙本質(zhì)細(xì)胞或成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞形成第三期牙本質(zhì)的過(guò)程中伴隨DSPP基因表達(dá)，那么成牙本質(zhì)細(xì)胞內(nèi)TLR9信號(hào)途徑在被細(xì)菌DNA活化后是否調(diào)控DSPP基因表達(dá)國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)研究報(bào)道。
　　綜上所述本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法對(duì)TLR9、DSPP基因進(jìn)行研究，旨

4、在闡明TLR9介導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞天然免疫反應(yīng)和調(diào)控DSPP基因表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑。探討齲病進(jìn)展過(guò)程中，細(xì)菌DNA感染、成牙本質(zhì)細(xì)胞免疫反應(yīng)、DSPP基因表達(dá)與第三期牙本質(zhì)形成相互之間的聯(lián)系，對(duì)闡明牙髓病病因、牙髓損傷修復(fù)的分子機(jī)制和DSPP基因表達(dá)調(diào)控規(guī)律有重要意義，為免疫防齲研究和活髓保存治療提供新的思路和途徑。
　　1TLR9、DSPP在成牙本質(zhì)細(xì)胞和牙髓組織中的表達(dá)
　　首先收集小鼠牙髓組織利用組織塊抽提RNA方法提取

5、總RNA，反轉(zhuǎn)錄，行PCR擴(kuò)增觀察TLR9mRNA在牙髓組織中的表達(dá)；其次從小鼠OLC成牙本質(zhì)細(xì)胞系中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄，行PCR擴(kuò)增觀察TLR9mRNA、DSPPmRNA的表達(dá)。1％瓊脂糖凝膠電泳顯TLR9mRNA在小鼠牙髓組織中和OLC細(xì)胞系中均有顯著表達(dá)，DSPPmRNA在OLC細(xì)胞系中有顯著表達(dá)。TLR9mRNA分子量198bp，DSPPmRNA分子量151bp。
　　2CpGDNA對(duì)OLC細(xì)胞內(nèi)TLR9、DSPP基因表

6、達(dá)調(diào)控
　　6孔板培養(yǎng)OLC細(xì)胞，用CpGODN-A和CpGODN-B刺激細(xì)胞，設(shè)置時(shí)間梯度為0、3、6、9、12、24小時(shí)。提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄，行PCR擴(kuò)增和實(shí)時(shí)定量PCR以觀察TLR9mRNA、DSPPmRNA的表達(dá)量變化。1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果和實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示CpGODN-A刺激組中TLR9mRNA、DSPPmRNA表達(dá)量無(wú)明顯變化。CpGODN-B刺激組中TLR9mRNA、DSPPmRNA表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的

7、變化，6小時(shí)表達(dá)量最高，且6小時(shí)組是0小時(shí)組的3倍。
　　3參與CpGOND調(diào)控DSPP基因的表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑
　　三種細(xì)胞信號(hào)途徑抑制劑：ERK信號(hào)途徑抑制劑，PD98059；p38信號(hào)途徑抑制劑，SB203580；NF-κB信號(hào)途徑抑制劑，PDTC。OLC細(xì)胞經(jīng)以上三種抑制劑（濃度為30μmol/L）作用后，加入CpGODN-B刺激6小時(shí)后提取總RNA，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示ERK和NF-κB組DSPPmRNA表達(dá)明