TLR9信號(hào)通路在大鼠腦梗死后缺血組織中的表達(dá).pdf

1、背景：
　　 在世界范圍內(nèi)，腦卒中是死因排第二位的疾病，同時(shí)也是致殘的主要原因。隨著人口的老齡化，腦梗死的發(fā)病率還在不斷地攀升。而缺血性卒中(腦梗死)約占腦卒中的80％，目前被證明有效的藥物僅有溶栓藥和抗血小板劑。溶栓治療是目前最有效的治療手段，但溶栓治療的適應(yīng)癥非常嚴(yán)格而且具有潛在的風(fēng)險(xiǎn)(如顱內(nèi)出血)導(dǎo)致僅有極少數(shù)病人能接受溶栓治療。目前其它的治療手段療效還是差強(qiáng)人意。探索新的治療方法是顯得很有必要的。這需要全面地弄清缺血性腦

2、組織損傷的復(fù)雜機(jī)制。
　　 炎癥反應(yīng)是腦缺血再灌注后重要的病理生理過(guò)程，早期造成組織損傷，而后期可能還具有內(nèi)源性修復(fù)作用。近年的研究發(fā)現(xiàn)，先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分——Toll-1ike receptors(TLRs)介導(dǎo)了缺血性損傷，而對(duì)其中成員TLR9作用的研究才剛剛起步。TLR9在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞都有表達(dá)。并且擁有兩條不同的信號(hào)傳導(dǎo)通路，分別經(jīng)過(guò)NFκB或IRF7途徑，誘導(dǎo)促炎因子(TNF-α，IL-1

3、)或神經(jīng)保護(hù)分子(IFN-β，IFN-α)的產(chǎn)生。這兩條通路在腦缺血后不同階段如何發(fā)揮作用還不清楚。弄清TLR9信號(hào)通路在腦缺血損傷與修復(fù)中的作用以及TLR9信號(hào)通路下游傳導(dǎo)的具體機(jī)制，將有助于加深對(duì)TLRs所介導(dǎo)的缺血性損傷的了解，并有可能為腦梗死不同階段的治療提供多個(gè)新的靶點(diǎn)。
　　 研究目的：
　　 觀察腦缺血再灌注早期缺血腦組織TLR9信號(hào)的激活情況，弄清腦梗死早期兩條TLR9信號(hào)通路的被激活是否不同。
　

4、　 研究方法：
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　 健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠120只，清潔級(jí)，體重280-330g。人工晝夜節(jié)律飼養(yǎng)。
　　 2.缺血再灌注模型的制作
　　 參照Longa氏方法，并加以改良。缺血時(shí)間為1.5小時(shí)，到缺血時(shí)間后，將栓線拉回頸外動(dòng)脈主干中，從而實(shí)現(xiàn)再灌注。對(duì)照組不插線，其余操作同上。
　　 3.實(shí)驗(yàn)分組
　　 (1)動(dòng)物模型分組
　　

5、 1)6h組：1.5小時(shí)缺血再灌注，觀察點(diǎn)為術(shù)后6h：50只。
　　 2)3d組：1.5小時(shí)缺血再灌注，觀察點(diǎn)為術(shù)后3天：50只。
　　 3)6h-假手術(shù)組(Sham-operated group，6h)：10只。
　　 4)3d-假手術(shù)組(Sham-operated group，3d)：10只。
　　 (2)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)分組
　　 1)I1：1.5h IR MCAO模型，術(shù)后6h，缺血側(cè)(右

6、側(cè))；
　　 2)I2：1.5h IR MCAO模型，術(shù)后3d，缺血側(cè)(右側(cè))；
　　 3)C1：1.5h IR MCAO模型，術(shù)后6h，缺血對(duì)側(cè)；
　　 4)C2：1.5h IR MCAO模型，術(shù)后3d，缺血對(duì)側(cè)；
　　 5)S1：假手術(shù)組，術(shù)后6h，右側(cè)；
　　 6)S2：假手術(shù)組，術(shù)后3d，右側(cè)；
　　 4.TTC染色
　　 取部分標(biāo)本行該項(xiàng)染色，以確定梗死灶。取厚約1.5m

7、m的冠狀切面的腦組織(不固定)，加入2％TTC溶液約30ml，避光、37℃孵育30min。
　　 5.RT-PCR
　　 取大鼠的前囟冠狀面的雙側(cè)額頂葉的大腦皮層，分別提取RNA，檢測(cè)TLR9，TNF-α、IFN-β、IRF7的mRNA表達(dá)水平。
　　 6.Western-Blot
　　 取大鼠的前囟冠狀面的雙側(cè)額頂葉的大腦皮層，分別提取蛋白，檢測(cè)TLR9，TNF-a，IFN-B的蛋白表達(dá)水平。
　

8、　 7.圖像分析
　　 利用Quantity One(ver4.6.2)對(duì)所得的電泳圖像作分析。比較目標(biāo)條帶與內(nèi)參的光密度比值。
　　 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 采用SPSS for Windows Ver.16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)分析，結(jié)果用(x)±s表示，p＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1.模型的成功率和死亡率
　　

9、用于本實(shí)驗(yàn)共120只大鼠，其中對(duì)照組(6h、3d)各10只，術(shù)后無(wú)一死亡。1.5h IR MCAO模型成功率(術(shù)后出現(xiàn)癱瘓且開顱排除并發(fā)腦出血：圖3)為82％。1.5hIR后6h組死亡率為17.5％，3d組為38.1％，由于失敗率和死亡率，實(shí)際成功的MCAO大鼠模型為50只，其中1.5hIR-6h組有25只，1.5hIR-3d組有25只。
　　 2.TTC染色
　　 根據(jù)Longa氏法并加以改良的手術(shù)方法，1.5h IR

10、后能成功誘導(dǎo)大鼠MCAO模型。術(shù)后大鼠出現(xiàn)明顯的左上肢癱瘓、轉(zhuǎn)圈、追尾征。TTC染色示缺血側(cè)(右側(cè))大腦半球可見明顯白色梗塞灶(圖4)。I1組和I2組的梗死體積分別為126.6±11.14mm3和129.6±7.23m3，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(t檢驗(yàn))，p為0.485，無(wú)明顯差異。
　　 3.RT-PCR結(jié)果
　　 (1)從大鼠腦組織中提取總RNA，可見完整的285、18S、5S三條帶(圖5)。
　　 (2)TLR9的m

11、RNA的表達(dá)情況(圖6)。
　　 I1組的相對(duì)表達(dá)量為0.4334±0.0286，I2組為0.9326±0.0291。在缺血側(cè)的表達(dá)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增高(p=0.000)，而在缺血對(duì)側(cè)和對(duì)照組，TLR9 mRNA未檢出。
　　 (3)TNF-α的mRNA的表達(dá)情況(圖7)。
　　 I1組的相對(duì)表達(dá)量為1.2086±0.1006，I2組為2.2625±0.1611，C1組為0.4431±0.0385，C2組為0.47

12、22±0.0422。TNF-αmRNA在缺血側(cè)的表達(dá)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯增高(p=0.000)，缺血對(duì)側(cè)TNF-αmRNA的亦有表達(dá)，且缺血對(duì)側(cè)的表達(dá)未隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加(p=0.451)。TNF-αmRNA在缺血側(cè)表達(dá)比缺血對(duì)側(cè)更高(p=0.000[I1 vs C1]，p=0.000[I2 vs C2]).對(duì)照組未見TNF-αmRNA表達(dá)。
　　 (4)IRF7 mRNA表達(dá)情況(圖8)。
　　 I1組的相對(duì)表達(dá)量為0.

13、4418±0.0386，I2組為1.2667±0.168，IRF7 mRNA在缺血側(cè)的表達(dá)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯上升(p=0.000)，在缺血對(duì)側(cè)與對(duì)照組未見IRF7 mRNA的表達(dá)。
　　 (5)IFN-β mRNA的表達(dá)情況(圖9)。
　　 I1組的相對(duì)表達(dá)量為0.1487±0.0209，I2組為0.2596±0.0336，IFN-βmRNA在缺血側(cè)的表達(dá)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯上升(p=0.009)，在缺血對(duì)側(cè)與對(duì)照組未見I

14、FN-β mRNA的表達(dá)。
　　 (6)RT-PCR結(jié)果匯總分析
　　 6h和3d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，缺血側(cè)TNF-αmRNA的表達(dá)明顯高于IFN-β mRNA的表達(dá)(p=0.000[6h]，p=0.000[3d])(見圖10)。
　　 4.Western-Blot結(jié)果
　　 (1)TLR9蛋白的表達(dá)情況(圖11&表2)。
　　 TLR9蛋白在缺血側(cè)的表達(dá)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯增高(p=0.000).在相同的

15、時(shí)間點(diǎn)，TLR9蛋白在缺血側(cè)的表達(dá)明顯高于缺血對(duì)側(cè)(p=0.000[6h]，p=0.000[3d])。相同的時(shí)間點(diǎn)缺血對(duì)側(cè)和對(duì)照組沒(méi)有明顯差別(p=0.519[6h]，p=0.515[3d])，缺血對(duì)側(cè)以及對(duì)照組的表達(dá)沒(méi)有隨時(shí)間的變化而變化(p=0.913[C1 vsC2]，p=0.894[S1 vs S2])。
　　 (2)TNF-α的蛋白表達(dá)情況(圖12&表3)：TNF-α蛋白在缺血側(cè)的表達(dá)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯增高(p=0.0

16、42).在相同的時(shí)間點(diǎn)，TNF-α蛋白在缺血側(cè)的表達(dá)明顯高于缺血對(duì)側(cè)(p=0.000[6h]，p=0.000[3d])。缺血對(duì)側(cè)的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(p=0.003[6h]，p=0.000[3d])。缺血對(duì)側(cè)和對(duì)照組的表達(dá)情況沒(méi)有明顯的隨時(shí)間變化而變化(p=0.744[C1 vs C2]，p=0.696[S1 vs S2])。
　　 (3)IFN-β的蛋白表達(dá)情況(圖13&表4)：IFN-β蛋白在缺血側(cè)的表達(dá)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯增

17、高(p=0.001).在相同的時(shí)間點(diǎn)，IFN-β蛋白在缺血側(cè)的表達(dá)明顯高于缺血對(duì)側(cè)(p=0.004[6h]，p=0.000[3d])。缺血對(duì)側(cè)的表達(dá)與對(duì)照組沒(méi)有明顯差別(p=0.449[6h]，p=0.608[3d])。缺血對(duì)側(cè)和對(duì)照組的表達(dá)情況沒(méi)有明顯的隨時(shí)間變化而變化(p=0.607[C1 vs C2]，p=0.089[S1 vs S2])。
　　 (4)Western-blot蛋白分析結(jié)果匯總(圖14)：在相同的時(shí)間點(diǎn)，缺