大鼠腦梗死后乏氧組織長時間存在與星形膠質(zhì)細(xì)胞的關(guān)系.pdf

1、本研究目的: 1.探索星形膠質(zhì)細(xì)胞與乏氧組織分布的關(guān)系； 2.研究腦梗死后乏氧組織的動態(tài)變化與星形膠質(zhì)細(xì)胞的關(guān)系。 3.研究腦梗死后乏氧組織的持續(xù)時間與星形膠質(zhì)細(xì)胞的關(guān)系。 實驗過程: 1、實驗動物： 健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠43只，體重280～330g，清潔級，人工晝夜節(jié)律飼養(yǎng)。 2、缺血再灌注模型的制作： 參照Longer氏法，稍加改良。到缺

2、血預(yù)定觀察時間點后，將栓線拉回到ECA的主干中，從而實現(xiàn)再灌注。持續(xù)缺血組不拔線。假手術(shù)組不插線，其余操作同上。 3、實驗分組： 分3組：1.5h缺血再灌注(1.5h IR)組、持續(xù)缺血(PI)組和假手術(shù)組(S組)；1.5hIR組和PI組再分術(shù)后1d、3d、7d、14d四個亞組，每個亞組5只大鼠。S組共3只大鼠。 4、EF5和GFAP的免疫雙標(biāo)： 乏氧標(biāo)記采用乏氧標(biāo)記物2-(2-nitro—lH—imid

3、azole-1-yl)—N—(2，2，3，3，3-pentafluoropropyl) Acetamide(簡稱EF5)，由美國賓夕法尼亞大學(xué)的Cameron J Koch教授饋贈。采取膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidicprotein，GFAP)標(biāo)記活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞。 1.5h IR組和PI組：在每個觀察時間點，每只大鼠以EF5溶液(生理鹽水溶解，3mg/ml)按1ml/100g體重的劑量從尾靜脈

4、注射進(jìn)體內(nèi)，4h后心臟灌注，迅速開顱取腦；OCT包埋后，以視交叉為中心間斷連續(xù)冰凍切片，每隔0.5mm切一張片，每個組織共5張片。切片以4％多聚甲醛固定后，依次以0.3％TritonX100和10％山羊血清處理；以GFAP多克隆一抗(1：200稀釋，由武漢博士德生物技術(shù)公司提供)4℃孵育過夜，ttPBS和PBS浸泡后再以FITC標(biāo)記的二抗(1：50稀釋，由武漢博士德生物技術(shù)公司提供)室溫、避光孵育2h；接著以4％多聚甲醛室溫、避光重新固

5、定20min，ttPBS和PBS浸泡，以10％山羊血清重新封閉1h；ttPBS和PBS浸泡后，以Cy3標(biāo)記的ELK3-51避光、4℃孵育過夜。ttPBS和PBS浸泡后，50％甘油封片。熒光顯微鏡下觀察。乏氧組織呈紅色熒光，GFAP呈綠色熒光。 S組不需靜脈注射EF5溶液，僅進(jìn)行GFAP染色。 5、組織分區(qū)： 將梗死側(cè)大腦半球的周圍皮質(zhì)區(qū)依次分為A、B、C三個區(qū)(圖2)，顯微鏡下以×200的倍數(shù)進(jìn)行觀察。

6、 6、圖像分析及GFAP熒光強(qiáng)度計算方法： 利用Adobe Photoshop CS2專業(yè)圖形分析軟件對雙標(biāo)的乏氧圖片和GFAP染色圖片進(jìn)行重疊(圖層合并)。利用Image Pro Plus6.0專業(yè)圖像分析軟件對GFAP染色圖片進(jìn)行熒光強(qiáng)度計算。 7、統(tǒng)計學(xué)分析： 采用SPSS for Windows Ver．11.5統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。結(jié)果用(-X±s)表示，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。