大鼠腦梗死后軟腦膜血管的吻合對梗死灶的影響及相關分子機制的研究.pdf

1、研究背景:腦血管病是臨床常見的疾病，在全球范圍內(nèi)，腦血管病與心血管疾病、癌癥成為成人死亡的三大疾病。腦血管病中以缺血性腦血管?。↖schemic Cerebrovascular Disease，ICVD）最常見。已有研究表明，當發(fā)生急性大腦中動脈阻塞時，會有側(cè)支循環(huán)參與代償。這種側(cè)支代償?shù)慕⒂欣诟纳迫毖獏^(qū)的血供，挽救瀕臨死亡的神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞和血管內(nèi)皮細胞以及基質(zhì)細胞，從而有助于缺損神經(jīng)功能的修復。越來越多的研究表明，側(cè)支代償

2、的優(yōu)劣與腦梗死患者的預后、溶栓治療出血并發(fā)癥密切相關。側(cè)支循環(huán)的代償途徑分為三級：一級側(cè)支循環(huán)指通過Willis環(huán)的血流代償；二級側(cè)支循環(huán)指通過細小血管支（眼動脈、軟腦膜吻合支及皮質(zhì)內(nèi)吻合支等）實現(xiàn)的血流代償；三級側(cè)支循環(huán)屬于新生血管，一般在缺血數(shù)天后才可以形成。其中，軟腦膜吻合支是大腦中動脈嚴重狹窄或閉塞時重要的側(cè)支代償途徑。而關于大腦中動脈軟腦膜側(cè)支形成的具體過程、影響因素、相關分子機制尚未完全明了。腦缺血后血管的再生和重建涉及到多

3、種生長因子和細胞因子，例如血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β2（tansforming growth factor-β2，TGF-β2）、血管生成素（angiopoietins，Ang

4、）、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）等，其中bFGF是體內(nèi)最強的血管生成因子之一，具有促進神經(jīng)元的存活、神經(jīng)元的修復及再生、促進血管形成、擴張血管等作用。已有研究表明在肢體缺血后，bFGF參與了缺血組織側(cè)支血管的形成，而bFGF是否也參與了腦梗死后軟腦膜血管與閉塞大腦中動脈側(cè)支吻合的形成，目前仍未有研究。MMP-9的釋放和激活可造成血腦屏障的損害，從而導致腦水腫和腦出血，此外它也是血管再

5、生過程中細胞外基質(zhì)的重建所必需的因子。
　　目的：探討大鼠腦梗死后軟腦膜血管的吻合對梗死灶的影響，進一步探討軟腦膜血管吻合及梗死灶面積的變化與bFGF、MMP-9的表達的變化及細胞凋亡的變化的關系。
　　方法:
　　1.實驗分組及造模：SD大鼠64只，體重在250g-300g之間。隨機分為4組，分別為腦梗死術后第1天組、第3天組、第7天組及假手術組四個組，每組動物16只。參照Longa線栓法制作大腦中動脈阻塞模型(MC

6、AO)；假手術組除不插入栓線外，余操作步驟同腦梗死組。
　　2.行為學檢測：用Zea Longa評分方法對腦梗死組大鼠和假手術組大鼠進行神經(jīng)功能評分，評價各組神經(jīng)功能缺失情況。
　　3. TTC染色評估腦梗死面積；乳膠灌注評估軟腦膜血管吻合情況：分別在MCAO手術后第1天、第3天、第7天及在假手術術后第1天處死大鼠。將腦組織進行 TTC染色及乳膠灌注，觀察梗死面積的變化和軟腦膜血管的吻合情況。
　　4. HE染色和嗜銀

7、染色觀察腦組織病理學變化；bFGF、 MMP-9的免疫組化染色及TUNEL染色探討軟腦膜血管吻合對梗死灶面積的變化的影響的相關分子機制:分別在MCAO手術后第1天、第3天、第7天及在假手術術后第1天灌注固定大鼠，取腦，石蠟包埋后切片，片厚3μm。HE染色和嗜銀染色觀察腦組織的病理學變化。用免疫組織化學方法檢測梗死灶周邊皮質(zhì) bFGF的表達及梗死灶中MMP-9的表達。用TUNEL方法檢測梗死灶周邊皮質(zhì)細胞凋亡情況。
　　結(jié)果：

8、>　　1.除假手術組外，其余各組均出現(xiàn)了不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀，神經(jīng)功能評分結(jié)果分別為：1.88±0.62，2.44±0.63，1.75±0.68。其中神經(jīng)功能評分在術后第3天最高，除腦梗死組3天組與7天組之間神經(jīng)功能評分比較差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05）之外，腦梗死組其他亞組之間神經(jīng)功能評分比較差別無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　2. TTC染色可以看到假手術組大鼠未見明顯的梗死灶；腦梗死組大鼠均有不同程度的白色梗死灶

9、。腦梗死組各亞組腦梗死面積百分比（％）分別為：30.05±0.49，32.01±4.09，24.24±2.56，其中腦梗死面積百分比（%）在術后第3天達到高峰。除腦梗死組1天組與腦梗死組7天組，腦梗死組3天組與腦梗死組7天組比較差異有統(tǒng)計學意義之外（P<0.05），其他各亞組之間腦梗死面積百分比比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。乳膠灌注：在腦梗死大鼠術后第7天可見軟腦膜血管與閉塞的大腦中動脈形成良好的吻合。
　　3. HE染色

10、示：假手術組和腦梗死組非缺血側(cè)未見明顯異常。腦梗死組：術后第1天，右側(cè)大腦皮質(zhì)梗死灶內(nèi)可見組織結(jié)構(gòu)疏松、細胞間隙增大，可見空泡和液化灶，正常的神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，神經(jīng)元變性壞死，細胞核固縮、碎裂；在術后第3天，梗死灶內(nèi)細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞核較大、不規(guī)則；在術后第7天梗死灶內(nèi)的細胞形態(tài)多樣，梗死灶內(nèi)的細胞數(shù)目開始增加，在梗死灶內(nèi)可見管徑不一的再生血管，具有從軟腦膜向梗死灶內(nèi)生長的趨勢。嗜銀染色示：腦梗死組在術后第3天腦梗死灶開始出現(xiàn)再生血

11、管；在術后第7天在腦梗死灶內(nèi)可見大量不同管徑的再生血管，再生血管的數(shù)目明顯增多。
　　4.假手術組大鼠梗死灶周邊皮質(zhì)bFGF陽性表達較少。腦梗死組各亞組大鼠梗死灶周邊皮質(zhì)bFGF陽性細胞的數(shù)量高于假手術組，腦梗死組各亞組大鼠梗死灶周邊皮質(zhì)bFGF陽性細胞數(shù)分別為：17.67±4.03，19.83±2.14，36.17±3.19，其中梗死灶周邊皮質(zhì)bFGF陽性細胞數(shù)在術后第7天達高峰；除了腦梗死組1天組與7天組、腦梗死組3天組與7天

12、組之間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）之外，腦梗死其余各亞組之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　5.假手術組大鼠梗死灶皮質(zhì) MMP-9陽性表達較少。腦梗死組各亞組大鼠梗死灶皮質(zhì) MMP-9陽性細胞的數(shù)量高于假手術組，腦梗死組各亞組大鼠梗死灶皮質(zhì)MMP-9陽性細胞數(shù)分別為：22.17±3.43，38.33±4.93，13.33±2.07，其中腦梗死組MMP-9陽性細胞數(shù)在術后第3天達高峰，腦梗死組各亞組之間兩兩比較差

13、異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　6.假手術組大鼠腦組織中未見凋亡細胞。腦梗死組各亞組大鼠梗死灶周邊皮質(zhì)凋亡細胞的數(shù)量高于假手術組。腦梗死組各亞組大鼠梗死灶周邊皮質(zhì)凋亡細胞數(shù)分別為：94.60±9.48，143.67±17.37，74.33±4.97，其中腦梗死組術后第3天梗死灶周邊皮質(zhì)細胞凋亡達到高峰，腦梗死組各亞組之間 TUNEL染色陽性細胞數(shù)兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.通

14、過大鼠行為學檢測、腦組織TTC染色、HE染色證實我們的MCAO模型制作成功且大鼠的神經(jīng)功能評分變化與腦梗死面積的變化及腦梗死灶的病理變化有關。
　　2. MCAO術后第7天神經(jīng)功能的改善、腦梗死面積的縮小可能與軟腦膜血管與閉塞的大腦中動脈形成良好的吻合后減少梗死灶周邊皮質(zhì)細胞的凋亡有關；在腦梗死術后第3天梗死腦組織腫脹，梗死面積增大，擬與MMP-9介導的腦水腫有關。
　　3. bFGF的表達升高與促進軟腦膜血管與閉塞大腦中動