外源性激肽釋放酶對腦梗死后神經(jīng)、血管再生及遠(yuǎn)隔損傷影響的實驗研究.pdf

1、本研究選擇了外源性激肽釋放酶而不是腺病毒轉(zhuǎn)染的激肽釋放酶基因作為治療藥物。 目的：觀察外源性激肽釋放酶對實驗性大腦皮層梗死后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移和分化的影響以及對梗死灶周血管再生的影響，并探討腦梗死后血管再生和神經(jīng)再生之間可能存在的關(guān)系。 第一部分分成體內(nèi)實驗和體外實驗。 首先，采用易卒中型腎血管性高血壓大鼠(stroke-prone renovascular hypertensive rats，RHRSP

2、)72只，隨機分為局灶性大腦皮層梗死+激肽釋放酶治療組(簡稱激肽釋放酶治療組)、局灶性大腦皮層梗死+溶劑對照組(簡稱溶劑對照組)和假手術(shù)對照組(每組24只)，其中激肽釋放酶治療組和溶劑對照組分別于右側(cè)大腦中動脈皮層支閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)后24h起連續(xù)2d或6d尾靜脈注射激肽釋放酶(0.5ml，1.6×10-2 PNAU／kg／d)或等量溶劑。假手術(shù)對照組僅暴露大腦中動脈而不凝

3、閉。所有大鼠均腹腔注射5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU，Sigma-Aldrich，St．Louis，MO，USA，50mg／kg，每天兩次)用以標(biāo)記新增殖的細(xì)胞。分別在MCAO或假手術(shù)后3d、7d、14d和28d行神經(jīng)功能評分后處死大鼠(每組每個時間點6只)，測腦梗死灶體積，通過免疫熒光標(biāo)記法檢測各組大鼠在術(shù)后不同時間點梗死側(cè)側(cè)腦室下區(qū)(the subventricular zone，SVZ)BrdU+、BrdU+／DCX+和BrdU+

4、／nestin+的表達(dá)，以及梗死灶周BrdU+、BrdU+／NeuN+、BrdU+／GFAP+的表達(dá)及梗死灶周血管密度的變化。 體外實驗通過觀察毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)形成實驗，進一步探討KKS對血管形成的影響。將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)株以4×109/m2。的細(xì)胞量接種于預(yù)涂有Matrigel的24孔培養(yǎng)板內(nèi)進行培養(yǎng)，實驗分三組：(1)正常對照(Con

5、trol)組：僅含無血清的DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)； (2)緩激肽(Bradykinin)組：加入不同濃度(1、10mmol／L)Bradykinin； (3)緩激肽+B2受體拮抗劑HOE-140組：含不同濃度的Bradykinin和B2受體拮抗劑HOE-140(10mmol／L)。然后置于37℃含5％CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，6小時后觀察各孔板中毛細(xì)血管樣管腔結(jié)構(gòu)的形成情況。 第二部分然后采用RHRSP48只，隨機分成右

6、側(cè)MCAO組和假手術(shù)組(每組24只)。兩組大鼠在MCAO或假手術(shù)后24h起連續(xù)2d或6d經(jīng)腹腔注射BrdU(50 mg／kg，每天兩次)用以標(biāo)記新增殖的細(xì)胞。分別在MCAO或假手術(shù)后3d、7d、14d和28d處死大鼠(每組每個時間點6只)，通過HE染色確定腦梗死灶定位，通過免疫熒光標(biāo)記法檢測兩組大鼠在術(shù)后不同時間點手術(shù)側(cè)丘腦VPN的NeuN+、OX-42+、BrdU+、nestin+、BrdU+／nestin+、BrdU+／NeuN+及

7、nestin+／GFAP+的表達(dá)，以及手術(shù)側(cè)丘腦VPN內(nèi)血管密度的變化。 第三部分再采用RHRSP48只制作局灶性大腦皮層梗死模型，隨機分成激肽釋放酶治療組(24只)和溶劑對照組(24只)，分別于右側(cè)大腦中動脈閉塞(MCAO)后24h起連續(xù)2d或6d尾靜脈注射激肽釋放酶(0.5ml，1.6×10-2 PNAU／kg／d)或等量溶劑。所有大鼠均腹腔注射BrdU(50 mg／kg，每天兩次)用以標(biāo)記新增殖的細(xì)胞。分別在MCAO或假手

8、術(shù)后3d、7d、14d和28d處死大鼠(每組每個時間點6只)，通過免疫熒光標(biāo)記法檢測兩組大鼠在術(shù)后不同時間點手術(shù)側(cè)丘腦VPN的NeuN+、OX-42+、BrdU+及nestin+的表達(dá)，以及手術(shù)側(cè)丘腦VPN內(nèi)血管密度的變化。 結(jié)論： 1.外源性激肽釋放酶能促進大鼠大腦皮層梗死后神經(jīng)功能的改善并促進內(nèi)源性神經(jīng)再生和梗死灶周血管再生。 2.腎性高血壓大鼠大腦皮層梗死后同側(cè)丘腦VPN內(nèi)存在神經(jīng)再生和血管再生現(xiàn)象。