正丁基苯酞對(duì)腦梗死后神經(jīng)功能恢復(fù)作用的機(jī)制研究.pdf

1、目的:腦血管病是我國(guó)居民死亡的首要原因和造成成人殘疾的第一原因，其中以缺血性腦血管病最為常見(jiàn)。雖然神經(jīng)元不能再生，但是臨床資料顯示，存活的腦卒中患者，均顯示出不同程度的功能恢復(fù)，提示腦組織具有自我修復(fù)能力。近年來(lái)，科學(xué)家們不斷發(fā)現(xiàn)神經(jīng)可塑性在腦卒中患者和腦梗死動(dòng)物模型中起到功能恢復(fù)的作用。神經(jīng)可塑性從組織結(jié)構(gòu)層面來(lái)講指的是軸突、樹(shù)突的分支，樹(shù)突棘的密度，突觸數(shù)量和大小，受體的密度和某些大腦區(qū)域神經(jīng)元的數(shù)量等。這些結(jié)構(gòu)共同構(gòu)成了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和

2、腦卒中后的功能恢復(fù)基礎(chǔ)。因此，如何提高腦梗死后神經(jīng)的可塑性為臨床治療腦梗死提供了新的治療策略。
　　Sonic hedgehog(Shh)信號(hào)通路是一高度保守的分泌性糖蛋白，是hedgehog蛋白家族三大成員Sonic hedgehog(Shh)，Desert hedgehog(Dhh)和Indian hedgehog(Ihh)之一。當(dāng)Shh蛋白與Ptch結(jié)合后，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Gli家族轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的促存活反應(yīng)。脊椎動(dòng)物的Gli家族包

3、括Gli1、Gli2和Gli3，其激活后由胞漿轉(zhuǎn)位至胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用。研究顯示Shh信號(hào)通路在胚胎期中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中起重要作用，它可以調(diào)控細(xì)胞的分化和增殖，同時(shí)它可以在腦損傷后誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞再生，參與血管重構(gòu)。我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腦梗死后Shh信號(hào)通路重新激活，皮層缺血組織的Shh/Ptch1/Gli1表達(dá)較對(duì)照組顯著增加，特異性阻斷Shh/Ptch1/Gli1信號(hào)通路后，神經(jīng)功能損傷加重，腦梗死體積增大，提示Shh信號(hào)通

4、路在腦卒中后神經(jīng)保護(hù)治療中起重要作用。
　　生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43(Growth Associated Protein43，GAP43)可以高水平表達(dá)于神經(jīng)元軸突發(fā)育過(guò)程中，是軸突和突觸前的重要組成部分。GAP43在大腦發(fā)育、腦損傷或腦缺血過(guò)程中可被用作為一個(gè)新的軸突生長(zhǎng)的可靠的標(biāo)志。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain derived neurotrophic factor，BDNF)是廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的蛋白質(zhì)。BDNF在中樞神經(jīng)系

5、統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中，對(duì)神經(jīng)元的分化、生長(zhǎng)及存活發(fā)育起重要作用，并且其能防止神經(jīng)元受損傷死亡、改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)、促進(jìn)受損傷神經(jīng)元再生及分化等生物效應(yīng)。因此BDNF是成熟的中樞及周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元維持生存及正常生理功能所必需的蛋白質(zhì)。
　　正丁基苯酞（dl-3-n-butylphthalide，NBP）又名丁苯酞，是我國(guó)自主研發(fā)的治療缺血性腦血管病的國(guó)家一類(lèi)新藥。NBP最初是由芹菜籽中提取而來(lái)。以往的研究已經(jīng)證明NBP具有較強(qiáng)的抗腦缺

6、血作用:明顯改善腦缺血區(qū)微循環(huán)和血流量，增加缺血區(qū)毛細(xì)血管數(shù)量，縮小梗死面積，減輕腦水腫，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善能量代謝，抑制血栓形成及血小板聚集等。但是有關(guān)NBP對(duì)卒中后神經(jīng)功能恢復(fù)的機(jī)制尚不清楚。
　　本實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)性小鼠局灶性大腦中動(dòng)脈皮層梗死(distal middlecerebral artery occlusion，dMCAO)模型的基礎(chǔ)上觀(guān)察腦缺血后應(yīng)用NBP，從手術(shù)后急性期至術(shù)后4周腦缺血損傷后的神經(jīng)保護(hù)作用，NBP

7、對(duì)Shh/Ptch1/Gli1通路和GAP43和BDNF因子的影響以及NBP對(duì)于軸突和樹(shù)突，樹(shù)突棘的影響。
　　方法:實(shí)驗(yàn)分為三部分:實(shí)驗(yàn)一，NBP的腦保護(hù)作用研究;實(shí)驗(yàn)二，NBP治療組的Shh/Ptch1/Gli1及GAP43和BDNF含量變化;實(shí)驗(yàn)三，NBP對(duì)于軸突與樹(shù)突和樹(shù)突棘神經(jīng)可塑性觀(guān)察。
　　實(shí)驗(yàn)一:采用成年健康雄性C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham）、溶劑對(duì)照組(Vehicle)、NBP小劑量(20

8、mg/kg)組(NBP-L)、及NBP大劑量(40 mg/kg)組(NBP-H)。制作小鼠局灶性大腦中動(dòng)脈皮層梗死模型(distal middle cerebral artery occlusion，dMCAO)。制備梗死模型1小時(shí)后立即于腹腔給予NBP(20 mg/kg或40 mg/kg)，或溶劑Tween-80(0.5％)。手術(shù)分為急性期和慢性期兩組。急性期于術(shù)后第3天至5天，7天至9天，14天至16天，慢性期于術(shù)后第14天至16天

9、及28天至30天分別進(jìn)行Rotarod Test神經(jīng)功能評(píng)分。
　　實(shí)驗(yàn)二:采用成年健康雄性C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham）、溶劑對(duì)照組(Vehicle)、NBP小劑量(20mg/kg)組(NBP-L)、及NBP大劑量(40 mg/kg)組(NBP-H)。干預(yù)組采取腹腔給藥。采用免疫組化法（Immunohistochemistry, IHC），免疫熒光共聚焦技術(shù)(ConfocolTechnique)檢測(cè)GAP43是

10、否表達(dá)及表達(dá)位置，蛋白印跡法(Western Blot)測(cè)定Shh/Ptch1/Gli1以及GAP43和BDNF的蛋白水平。
　　實(shí)驗(yàn)三:采用成年健康雄性C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham）、溶劑對(duì)照組(Vehicle)、NBP小劑量(20mg/kg)組(NBP-L)、及NBP大劑量(40 mg/kg)組(NBP-H)。干預(yù)組采取腹腔給藥。采用神經(jīng)元順行示蹤劑(Biotin dextran amine，BDA)研究NB

11、P對(duì)皮層組織神經(jīng)軸突生長(zhǎng)(axonl sprouting)的影響。采用高爾基染色法(Golgi-stain)觀(guān)察NBP對(duì)樹(shù)突和樹(shù)突棘的影響。
　　結(jié)果:
　　1、采用Rotarod評(píng)價(jià)小鼠神經(jīng)功能行為學(xué)。手術(shù)分為急性期和慢性期兩組。急性期和慢性期的Vehicle組、NBP小劑量(20mg/kg)組(NBP-L)、及NBP大劑量(40 mg/kg)組(NBP-H)小鼠均出現(xiàn)不同程度的左側(cè)肢體偏癱。急性期時(shí):NBP小劑量組與溶劑

12、對(duì)照組比較發(fā)現(xiàn)術(shù)后第4天，5天，7天，8天，9天，14天，15天，16天有差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Vehicle vs.NBP-L:4天:38.37±3.53 vs.51.14±3.31，P＜0.05;5天:43.74±3.34 vs.56.67±3.96,P＜0.05;7天:44.48±2.69 vs.66.16±4.39, P＜0.05;8天:44.42±2.28 vs.63.41±3.68,P＜0.05;9天:39.24±2.9

13、5 vs.69.94±5.14，P＜0.05;14天:38.97±4.33 vs.57.24±3.92，P＜0.05;15天:36.25±4.16 vs.50.62±4.28，P＜0.05;16天:33.19±5.27 vs.51.14±5.22，P＜0.05）。大劑量組與溶劑對(duì)照組比較發(fā)現(xiàn)術(shù)后第4天，5天，7天，9天，14天有差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Vehicle vs.NBP-H:4天:38.37±3.53 vs.48.51±3.

14、52,P＜0.05;5天:43.74±3.34 vs.55.32±3.93，P＜0.05;7天:44.48±2.69 vs.66.37±4.87,P＜0.05;9天:39.24±2.95 vs.69.94±5.14，P＜0.05;14天:38.97±4.33 vs.56.73±4.93，P＜0.05）。慢性期時(shí):NBP小劑量組與溶劑對(duì)照組比較發(fā)現(xiàn)術(shù)后第14天，15天，16天，28天，29天，30天有差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Vehicl

15、e vs.NBP-L:14天:22.30±1.55 vs.31.45±2.34，P＜0.05;15天:31.42±2.07 vs.42.28±2.56，P＜0.05;16天:28.88±2.28 vs.39.11±2.30,P＜0.05;28天:31.24±2.65 vs.41.61±2.37，P＜0.05;29天:31.66±2.73 vs.42.60±2.57,P＜0.05;30天:31.94±2.89 vs.52.70±3.29，

16、P＜0.05）而慢性期NBP大劑量組與溶劑對(duì)照組比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2、免疫組化法和免疫熒光共聚焦技術(shù)檢測(cè)到GAP43在腦梗死后可以表達(dá)。
　　3、NBP對(duì)Shh/Ptch1/Gli1通路及GAP43和BDNF表達(dá)的影響:NBP低劑量組NBP-L與溶劑對(duì)照組相比，Gli1在3天，7天蛋白水平的表達(dá)明顯增高(P＜0.05)，Ptch在7天，14天蛋白水平的表達(dá)明顯增高(P＜0.05)，Shh在14天的時(shí)候蛋白水平的表達(dá)明

17、顯增高(P＜0.05)，BDNF在3天，14天蛋白水平的表達(dá)明顯增高(P＜0.05);Ptch1在14天蛋白水平的表達(dá)明顯增高(P＜0.05)，BDNF在3天，14天蛋白水平的表達(dá)明顯增高（P＜0.05）。GAP43總蛋白與溶劑對(duì)照組比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　此外在測(cè)量低劑量組NBP-L和高劑量組NBP-H胞漿蛋白中發(fā)現(xiàn)Gli1在14天和28天與溶劑對(duì)照組相比蛋白水平的表達(dá)明顯增高(P＜0.05)。
　　4、高爾基染色發(fā)現(xiàn)N