移植人骨髓間充質干細胞促進大鼠腦梗死后神經(jīng)再生及功能恢復.pdf

1、目的:
　　 第三次全國死因調查結果顯示,腦血管病已成為我國城鄉(xiāng)居民首位死亡原因,占死亡總數(shù)的22.45％,是單病種致死、致殘率最高的疾病,已成為嚴重的公共衛(wèi)生問題。腦梗死在腦血管病中最為常見,除發(fā)病4.5 h內及時溶栓治療外,腦梗死至今尚無切實有效的根治方法。
　　 上世紀末開始,干細胞研究迅速發(fā)展。在干細胞及其治療腦梗死的基礎和臨床前期研究方面成果眾多。骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived mes

2、enchymal stemcells,BMSCs)作為細胞治療的主要成員之一,具備取材方便、免疫原性低、很少涉及倫理、可自體移植等優(yōu)點。目前,動物實驗研究結果提示,BMSCs對腦梗死有治療作用,能促進腦梗死后神經(jīng)功能恢復；此外,臨床試驗近年來日益增多,部分結果證實BMSCs治療腦梗死安全且有效,這些均給腦梗死的臨床治療帶來希望。然而,BMSCs治療腦梗死的確切機制至今尚未研究清楚。起初倍受關注的“細胞替代學說”遭到質疑。目前,大多學者認

3、為,BMSCs的治療作用可能與其分泌的各種因子有關。
　　 腦梗死能誘發(fā)自身內源性神經(jīng)干/前體細胞(neural stem/progenitor cells,NSPCs)的增殖,這些增殖的細胞遷移到梗死灶周邊(ischemic boundaryzone,IBZ)并分化為神經(jīng)元和膠質細胞。但是,大部分增殖的內源性NSPCs會在數(shù)天內凋亡,對腦梗死后神經(jīng)功能的恢復作用有限。NSPCs的迅速凋亡可能與腦梗死后梗死周邊極度缺乏血運和營養(yǎng)

4、的惡劣微環(huán)境有關。本實驗就腦內移植BMSCs促進大鼠腦梗死后血管新生,改善梗死周邊微環(huán)境,從而激活內源性神經(jīng)再生的機制進行探討。
　　 方法:
　　 采集正常成人男性志愿者骨髓,分離、純化獲得人BMSCs(human BMSCs,hBMSCs),體外培養(yǎng)擴增至第5代,進行細胞表型鑒定和染色體分析。線栓法建立雌性SD大鼠大腦中動脈栓塞2 h再灌注模型(middle cerebral artery occlusion,MCA

5、O),隨機分為2組:①hBMSCs移植組,在模型建立后3 d,腦內立體定向移植hBMSCs5x105；②對照組,移植等體積生理鹽水10μ1。腹腔注射5-溴脫氧尿嘧啶(bromodeoxyuridine,BrdU),標記增殖的內源性NSPCs。(1)改良神經(jīng)損傷嚴重程度評分(modified neurological severity scores,mNSS)和粘貼物移除實驗分別評估神經(jīng)功能恢復情況；(2)伊紅.蘇木素染色計算大鼠相對腦梗

6、死體積；(3)18F—FDGmicro-PET分析大鼠移植hBMSCs前后腦梗死周邊代謝的變化；(4)BrdU和vWF熒光雙染標記增殖的血管內皮細胞,CD31標記新生血管；(5)激光多普勒血流儀檢測腦梗死周邊腦血流變化；(6)BrdU、Nestin和musashi1免疫熒光染色標記室管膜下區(qū)(subventricularzone,SVZ)和海馬齒狀回顆粒層下區(qū)(subgranularzone,SGZ)的NSPCs；(7)通過免疫熒光雙染

7、的方法研究NSPCs的遷移、分化和凋亡,BrdU+/DCX+細胞提示NSPCs向神經(jīng)元前體細胞分化,BrdU+/NeuN+細胞提示NSPCs向成熟神經(jīng)元分化,Brdu+/GFAP+細胞提示NSPCs向星形膠質細胞分化,BrdU+/TUNEL+細胞提示NSPCs凋亡；(8)western blot測定梗死側腦組織VEGF、nestin、musashi1、ki-67和DCX的表達量。(9)熒光原位雜交技術(fluorescence insi

8、tu hybridization,FISH)追蹤移植入大鼠腦內的hBMSCs。
　　 結果:
　　 1、MCAO模型后2 W開始,hBMSCs移植組和對照組比較,行為學恢復更為明顯,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表現(xiàn)為mNSS評分下降以及粘貼物移除實驗中大鼠去除粘貼物的時間縮短。
　　 2、MCAO模型后12 W,伊紅-蘇木素染色顯示右側大腦中動脈供血區(qū)域大腦皮質和基底核外側梗死灶,hBMSCs移植組大鼠相對

9、梗死體積為27.6％±4.8％,對照組大鼠相對梗死體積為36.4％±6.2％,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 3、MCAO模型后2 W,micro-PET結果顯示,hBMSCs移植組大鼠梗死側皮質和紋狀體攝取18F-FDG增加,代謝缺損較對照組減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 4、同對照組比較,hBMSCs移植組大鼠腦梗死周邊BrdU+/vWF+細胞和CD31陽性血管數(shù)量增多,梗死側大腦中動脈供血

10、區(qū)域腦血流(CBF)在MCAO模型后2w(移植細胞后11 d)明顯升高,腦梗死周邊VEGF表達量增加,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 5、同對照組比較,hBMSCs移植組SVZ區(qū)和SGZ區(qū)內源性NSPCs增殖、向IBZ區(qū)遷移以及向神經(jīng)元和星形膠質細胞分化均顯著增強,而NSPCs凋亡減少,另外,腦梗死側nestin、musashi1、ki-67和DCX的表達量增高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 6