層粘連蛋白及其受體整合素α6β1調(diào)控腦梗死后血管神經(jīng)再生的機(jī)的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　第三次全國(guó)死因調(diào)查結(jié)果顯示，腦血管病位居我國(guó)城鄉(xiāng)居民死亡原因的第一位，占死亡總數(shù)的22.45％，是單病種致死、致殘率最高的疾病，已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。腦梗死在腦血管病中最為常見[1]，在我國(guó)占到70％左右，在歐美國(guó)家比例則高達(dá)85％。因此重視腦梗死的預(yù)防和診治對(duì)整個(gè)社會(huì)具有極其重要的意義。但是，目前除發(fā)病4.5h內(nèi)及時(shí)溶栓治療外，腦梗死至今尚無切實(shí)有效的根治方法。然而，溶栓治療因?yàn)橹委煏r(shí)間窗過于短暫，僅有

2、很小部分腦梗死患者可以及時(shí)得到溶栓治療的機(jī)會(huì)，同時(shí)需要承擔(dān)治療后顱內(nèi)出血的風(fēng)險(xiǎn)[2]。腦梗死后的神經(jīng)功能損害持續(xù)終生，給患者本人、家庭及社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。因此，如何提高腦梗死的治療效果仍然是目前從事基礎(chǔ)和臨床研究的科研人員致力于解決和為之努力的核心問題。
　　近年來，圍繞腦梗死的研究眾多，其中，腦梗死后血管新生和內(nèi)源性神經(jīng)再生這兩種現(xiàn)象倍受關(guān)注[3,4]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn):腦梗死后促進(jìn)梗死周邊血管新生可以顯著激活內(nèi)源性神經(jīng)再

3、生，進(jìn)而達(dá)到更好的神經(jīng)功能恢復(fù)效果。然而，血管新生是否是促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)再生的直接原因有待進(jìn)一步研究;另外，參與其中的分子機(jī)制也需深入探討。本研究擬在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過上調(diào)和下調(diào)梗死周邊血管新生，探討腦梗死后血管新生和內(nèi)源性神經(jīng)再生兩者之間的關(guān)系;同時(shí)在上調(diào)和下調(diào)梗死周邊血管新生繼而促進(jìn)或減弱內(nèi)源性神經(jīng)再生后，研究受損神經(jīng)系統(tǒng)在大體解剖、行為學(xué)和功能影像學(xué)方面的變化;本研究還將深入探討層粘連蛋白及其受體整合素α6β1在調(diào)控腦梗死后血管

4、神經(jīng)再生過程中的分子機(jī)制。
　　方法：
　　線栓法建立雄性SD大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞2h再灌注模型(middlecerebralarteryocclusion，MCAO)。建模后24h，按照大鼠改良神經(jīng)功能缺失評(píng)分(modifiedneurologicalseverityscores，mNSS)，將評(píng)分10-13分的50只大鼠納入最終實(shí)驗(yàn)分組并隨機(jī)分為5組，每組10只:①A:未干預(yù)對(duì)照組;②B:VEGF上調(diào)血管組:建模后3d，模

5、型穩(wěn)定后梗死周邊植入osmotic微型泵(alzet1007D/kit2，100ul/1w)，累計(jì)VEGF4ug;③C:endostatin下調(diào)血管組:建模后3d，模型穩(wěn)定后梗死周邊植入osmotic微型泵(alzet1007D/kit2，100ul/1w)，累計(jì)endostatin20ug;④D:腦室注射CXCR4抗體組:建模后3d，模型穩(wěn)定后腦室植入osmotic微型泵(alzet1007D/kit2，100ul/1w)，累計(jì)ant

6、i-CXCR44ug;⑤E:腦室注射α6β1拮抗劑(GoH3抗體)組:建模后3d，模型穩(wěn)定后腦室植入osmotic微型泵(alzet1007D/kit2，100ul/1w)，累計(jì)GoH3抗體4ug。建模后第一天開始腹腔注射5-溴脫氧尿嘧啶(bromodeoxyuridine，BrdU)，標(biāo)記增殖的內(nèi)源性NSPCs。(1)改良神經(jīng)損傷嚴(yán)重程度評(píng)分(modifiedneurologicalseverityscores，mNSS)和粘貼物移除

7、實(shí)驗(yàn)分別評(píng)估神經(jīng)功能恢復(fù)情況;(2)18F-FDGmicro-PET分析大鼠注射VEGF、endostatin后腦梗死周邊代謝的變化;(3)BrdU與nestin、DCX、GFAP、NeuN及vWF熒光雙染標(biāo)記SVZ、梗死周邊及紋狀體區(qū)的NSPCs增殖、遷移、分化等情況;(4)SVZwholeamount:解剖分離出梗死側(cè)SVZ，通過BrdU標(biāo)記增殖干細(xì)胞、laminin標(biāo)記血管基質(zhì)、α6β1抗體標(biāo)記NSPCs等幾種指標(biāo)共染，研究NSP

8、Cs、層粘連蛋白、血管三者之間的關(guān)系，測(cè)量NSPCs與最近血管的距離，闡明SVZ的血管微環(huán)境。
　　結(jié)果：
　　1、MCAO模型后2W開始，VEGF組和對(duì)照組比較，行為學(xué)恢復(fù)更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表現(xiàn)為mNSS評(píng)分下降以及粘貼物移除實(shí)驗(yàn)中大鼠去除粘貼物的時(shí)間縮短。而endostatin組、anti-CXCR4組、GoH3組的行為學(xué)恢復(fù)較慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表現(xiàn)為mNSS評(píng)分下降較緩以及

9、粘貼物移除實(shí)驗(yàn)中大鼠去除粘貼物的時(shí)間改善不明顯。
　　2、MCAO模型后2w，micro-PET結(jié)果顯示，VEGF組大鼠梗死側(cè)皮質(zhì)和紋狀體攝取18F-FDG增加，代謝缺損較對(duì)照組減少。
　　3、同對(duì)照組比較，VEGF組大鼠腦梗死周邊BrdU+/vWF+細(xì)胞數(shù)量增多，腦梗死周邊VEGF表達(dá)量增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而endostatin組、anti-CXCR4組、GoH3組的細(xì)胞較少，VEGF表達(dá)減少，差異有

10、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)
　　4、同對(duì)照組比較，VEGF組SVZ區(qū)和SGZ區(qū)內(nèi)源性NSPCs增殖、向梗死周邊遷移均顯著增強(qiáng)。
　　結(jié)論：
　　腦梗死后促進(jìn)血管新生可以更好得為增殖、遷移、分化的NSPCs提供良好的血管微環(huán)境，從而進(jìn)一步促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)再生;正是借助整合素α6β1和層粘連蛋白的相互作用，使得NSPCs始終和血管保持緊密聯(lián)系;在血管微環(huán)境提供的支持下以及在SDF-1的趨化作用下，NSPCs得以從SVZ區(qū)“健