何首烏飲對運動性疲勞大鼠睪丸間質(zhì)細胞的影響.pdf

1、運動性疲勞是指高強度超負荷的連續(xù)運動,機體機能和運動負荷不能彼此適應,所導致的疲勞連續(xù)性積累,繼而所引發(fā)的一系列的機體功能紊亂或是病理狀態(tài)的產(chǎn)生。疲勞還將伴隨有一定的健康損害,即由于運動引起的機體生理和生化的改變,致使機體運動能力的暫時性下降。傳統(tǒng)中藥在延緩和消除疲勞方面具有獨特的優(yōu)勢,其中補腎方劑何首烏飲由《宣明論方》何首烏丸加味而成,在何首烏、肉蓯蓉、懷牛膝的基礎上增加淫羊藿、丹參、茯苓,具有補肝腎、益精血、延年益壽,消除疲勞之功效

2、。本研究對運動性疲勞大鼠進行中藥干預,觀察其對運動性疲勞大鼠的血生化指標和睪酮合成限速酶P450scc和StAR以及睪丸胞內(nèi)膽固醇合成限速酶HMG-CoA和SR-BI的表達影響。為進一步研究中藥抗運動性疲勞的作用及機理奠定理論和實驗基礎。
　　目的:
　　采用生物化學、免疫組織化學、RT-PCR和WesternBlotting方法,通過檢測各組大鼠的血生化指標以及睪丸組織P450scc、StAR和HMG-CoA、SR-BI的

3、表達。探討何首烏飲緩解運動性疲勞的機制。
　　方法:
　　1.實驗動物的選擇及分組:選用8周齡清潔級SD(Sprague–Dawley,SD)雄性大鼠75只,(動物由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供,合格證編號1005050),每只體重為180～200g。自由進食,飲水,室溫20℃-25℃,相對濕度45％-55%,每天光照12h,隨機分為6組:安靜對照組(A組)、安靜何首烏飲組(B組)、模型組(C組)、自然恢復組(D組)、何首烏

4、飲治療組(E組)和何首烏飲預防組(F組),每組15只。
　　2.建立大鼠運動性疲勞模型:游泳池內(nèi)壁光滑呈圓形,直徑約50cm,水深70cm,水溫30℃±2℃。第一周進行適應性游泳訓練,每天一次,共七次。第1天下水游泳30min,此后逐日按照40%幅度增加至第7天游泳2h;從第二周開始適應性負重游泳訓練,第一次負重自身體重的0.5%,此后逐日遞增,負1%、2%、3%、4%每次游泳2h,每天一次。當?shù)诹熵撝卦黾拥?%時,游泳時間明顯

5、縮短,所以選擇自身體重的4%作為最終的負重量;此后六周每天一次進行游泳力竭實驗(游泳力竭標準為大鼠游泳出現(xiàn)明顯不協(xié)調(diào),經(jīng)水面下沉10s后仍不能上浮,且放置平面無法完成翻正反射)。
　　3.各組處理:A組大鼠不進行游泳訓練,每天灌胃等量生理鹽水。B組大鼠不進行游泳訓練,每天灌胃何首烏飲20g/(kg.d)。在制作運動疲勞模型過程中,C組、D組、E組和F組大鼠每天下午進行力竭游泳訓練,其中F組在上午灌胃何首烏飲20g/(kg.d)進行

6、預防,連續(xù)六周。在造模的第42d各組大鼠經(jīng)內(nèi)眥眶后靜脈取血約1.5mL,離心取上清,檢測血清睪酮、血尿素氮、血乳酸,血漿血紅蛋白和血清肌酐來判斷造模是否成功。判斷標準:與安靜對照組比較模型組大鼠血清睪酮含量明顯降低;血尿素氮含量和血乳酸濃度明顯升高;血紅蛋白含量降低;血肌酐明顯升高;且大鼠出現(xiàn)食量減少,體重下降,運動遲緩等現(xiàn)象表明模型已建立成功。在造模成功后,將C組大鼠處死;D組大鼠自由進食飲水,不給予任何干預;E組大鼠每天灌胃何首烏飲

7、20g/(kg.d)進行治療;F組大鼠停訓即停藥,自由進食飲水,連續(xù)60天。
　　4.標本采集與處理:實驗結(jié)束后,將各組大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉,經(jīng)眼內(nèi)眥眶后靜脈從取血約2ml,1000r/min離心20min,吸取上清液置-80℃低溫冰箱保存待測,然后經(jīng)左心室向升主動脈插管快速灌注預冷的焦炭酸二乙酯(DEPC)處理的生理鹽水約250ml直到流出的液體變清為止,迅速取出左側(cè)睪丸組織投入液氮,30min后移到-80℃低溫保存

8、,以備用作Westernblotting、RT-PCR測定。右側(cè)睪丸組織經(jīng)4%多聚甲醛灌注固定、石蠟包埋以備用作免疫組織化學染色。
　　結(jié)果:
　　1.一般情況觀察:安靜對照組和安靜何首烏飲組大鼠皮毛光潔整齊,活動自如,精神狀態(tài)良好。其余四組大鼠普遍精神倦怠,運動遲緩,反應淡漠,皮毛脫落,體型瘦弱,飲食減退,體重下降。
　　2.血清睪酮和血紅蛋白:模型組大鼠與安靜對照組大鼠相比血清睪酮含量明顯降低,血紅蛋白含量有所降低

9、,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);何首烏飲治療組、預防組比模型組大鼠血清睪酮含量明顯升高,血紅蛋白含量有所升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);預防組大鼠與治療組大鼠相比血清睪酮含量和血紅蛋白含量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　3.血乳酸、血肌酐和血清尿素氮:模型組大鼠與安靜對照組大鼠相比血乳酸濃度,血肌酐含量和血清尿素氮含量明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);何首烏飲治療組、預防組大鼠比模型組大鼠血乳酸濃度,

10、血肌酐含量和血清尿素氮含量明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);預防組大鼠與治療組大鼠相比血乳酸,血肌酐含量和血清尿素氮無顯著差異(P>0.05)。
　　4.免疫組織化學結(jié)果:P450scc免疫組化陽性顆粒為棕黃色顆粒主要表達于間質(zhì)細胞胞質(zhì)和精母細胞胞質(zhì),B組、E組和F組陽性信號強于D組和A組(P<0.05),A組強于C組(P<0.05)。HMG-CoA免疫組化陽性顆粒主要表達于睪丸間質(zhì)細胞胞質(zhì),B組和F組表達最弱,C組最強

11、,與其余各組相比有統(tǒng)計學意義。STAR和SR-BI免疫組化陽性顆粒主要表達于睪丸間質(zhì)細胞胞質(zhì),B組、E組和F組陽性信號強于A組和D組(P<0.05),C組陽性信號最弱。
　　5.Westernblotting和RT-PCR結(jié)果:P450scc蛋白和mRNA表達變化為:B組、E組和F組明顯高于D組和A組(P<0.05),C組明顯低A組(P<0.05),A組和D組之間沒有顯著性差異;HMG-CoA蛋白和mRNA表達變化為:B組和F組明

12、顯低于E組、D組和A組(P<0.05),C組明顯高A組(P<0.05),A組和D組之間沒有顯著性差異;STAR和SR-BI蛋白和mRNA表達變化為:E組和F組明顯高于A組和D組(P<0.05),C組明顯低于A組(P<0.05),A組和D組之間沒有顯著性差異。
　　結(jié)論:
　　1.運動性疲勞大鼠模型的建立是成功的。
　　2.何首烏飲能夠提高運動性疲勞大鼠血清睪酮和血紅蛋白的濃度。
　　3.何首烏飲能夠顯著降低運動性