何首烏飲對衰老大鼠生精細胞凋亡機制的初步探討.pdf

1、目的：
　　探討何首烏飲對衰老大鼠生精細胞凋亡的可能機制。
　　方法：
　　1.根據實驗要求將雄性大鼠分為四組，每組各10只：青年對照組（12月齡）；自然衰老組（18月齡）；何首烏飲1組（何首烏飲4.8g/100g，灌胃60d，18月齡）；何首烏飲2組（何首烏飲4.8g/100g，灌胃30d，18月齡）觀察不同給藥時間藥物延緩衰老作用。
　　2.應用β-半乳糖苷酶試劑盒檢測β-半乳糖苷酶在各組睪丸組織中的表達。<

2、br>　　3.采用TUNEL熒光試劑盒觀察睪丸組織細胞凋亡率。
　　4.采用基因芯片技術篩選睪丸組織受何首烏飲調控的差異表達基因，實時熒光定量PCR(qRT-PCR)驗證芯片結果。
　　5.選出與細胞凋亡相關的差異表達基因，從中選取關鍵基因Caspase-3、DR6、BAX、14-3-3σ，采用qRT-PCR檢測在mRNA水平的改變；同時進行免疫熒光和Western blot觀察以上蛋白和Cytc在睪丸組織中的表達。

3、　　結果：
　　1.β-半乳糖苷酶表達β-半乳糖苷酶陽性產物呈藍色定位在細胞質。青年對照組藍色細胞較少，且主要分布在間質細胞；自然衰老組衰老細胞明顯增多且藍染細胞主要是精原細胞和間質細胞，β-半乳糖苷酶的陽性率明顯高于青年對照組（P<0.01）；何首烏飲用藥組發(fā)生衰老的細胞主要是間質細胞，β-半乳糖苷酶的表達比自然衰老組明顯減少（P<0.01）；用藥組之間比較何首烏飲1組β-半乳糖苷酶的表達明顯低于何首烏飲2組（P<0.01）。<

4、br>　　2.TUNEL檢測睪丸組織凋亡結果細胞核呈綠色熒光為凋亡細胞。青年對照組細胞凋亡較少，主要分布在間質細胞；自然衰老組凋亡陽性信號分布于各級生精細胞，偶見間質細胞，細胞凋亡率顯著高于青年對照組(P<0.01)；何首烏飲用藥組凋亡細胞主要是精原細胞和間質細胞，與自然衰老組比較凋亡細胞明顯減少(P<0.01)；且何首烏飲1組細胞凋亡率明顯低于何首烏飲2組(P<0.01)。
　　3.基因芯片篩選結果基因芯片共篩選出21260個基

5、因，受何首烏飲直接調控的基因有912個，其中衰老后691個基因表達明顯上調，221個基因表達下調，用何首烏飲干預60d后，上調的691個基因明顯下調，下調的221個基因明顯上調。通過Pathway分析受何首烏飲調控的與細胞周期調控和凋亡相關的通路共有13條。
　　4.qRT-PCR驗證芯片結果我們選擇了9個基因進行驗證，其中AK1,Glrx3,Cabin1，Kdm2b衰老后表達下調，何首烏飲用藥后表達上調；Ccng1,GHR,Ca

6、pn8,ADAM5,Cybrd1衰老后表達上調，何首烏飲用藥后表達下調。qRT-PCR結果與芯片結果一致，說明芯片結果可信。
　　5.qRT-PCR檢測Caspase-3、DR6、BAX、14-3-3σ在mRNA水平的改變與青年對照組相比，自然衰老組Caspase-3、DR6、BAX的表達明顯上調(P<0.01)，14-3-3σ的表達明顯下調(P<0.01)；何首烏飲1組Caspase-3、DR6、BAX的表達比自然衰老組有所下調

7、(P<0.01)，14-3-3σ的表達明顯上調(P<0.01)；何首烏飲2組Caspase-3、DR6的表達比自然衰老組有所下調(P<0.01)，14-3-3σ的表達無顯著性差異(P>0.05)；且Caspase-3、DR6在兩個用藥組之間無顯著性差異(P>0.05)。
　　6.免疫熒光和Western blot檢測結果 Caspase-3、Cytc、14-3-3σ陽性產物呈紅色顆粒，Caspase-3定位于各級生精細胞的胞核或胞

8、質，Cytc、14-3-3σ表達在各級生精細胞和間質細胞的胞質中。BAX陽性產物呈紅色顆粒，DR6陽性產物呈綠色顆粒，二者主要表達在間質細胞和精原細胞的胞質。Western blot檢測結果顯示與青年對照組相比，自然衰老組Caspase-3、Cytc、BAX、DR6表達明顯增加(P<0.01)，14-3-3σ表達明顯減少(P<0.01)；何首烏飲用藥組與自然衰老組大鼠比較Caspase-3、Cytc、BAX、DR6表達量明顯減少(P<0

9、.01)，14-3-3σ表達量明顯增加(P<0.01)；用藥組間相比，何首烏飲1組14-3-3σ表達量明顯高于何首烏飲2組(P<0.01)，何首烏飲1組BAX、Caspase-3、DR6、Cytc表達量明顯低于何首烏飲2組(P<0.01或P<0.05)。
　　結論：
　　1.何首烏飲能夠降低衰老標志物β-半乳糖苷酶的表達。
　　2.何首烏飲可以明顯減少自然衰老大鼠睪丸生精細胞的凋亡。
　　3.在睪丸組織中受何首烏