同種異體移植脂肪源干細胞對運動性疲勞大鼠的影響.pdf

1、背景:運動性疲勞是指機體在生理過程中不能維持其機能在一特定水平上和/或不能維持預(yù)定的運動強度,主要表現(xiàn)為運動員經(jīng)過一段時間的大強度訓(xùn)練或激烈的運動或比賽之后出現(xiàn)機體疲勞,無法達到原有的競技水平。如何延緩運動性疲勞的產(chǎn)生和加速其消除是運動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點?，F(xiàn)在大多數(shù)是研究藥物對機體的影響,以傳統(tǒng)中藥和中藥復(fù)方為多,也有一些合成藥物。研究表明,這些藥物均對機體運動疲勞的延緩或消除有一定影響,但效果不持久。
　　 原林教授提出的筋膜

2、學(xué)認為,整個有機體可分為支持與儲備系統(tǒng)和功能系統(tǒng)。生物通過支持儲備系統(tǒng)維持較長的生命周期和維持機體穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境。功能系統(tǒng)在支持與儲備系統(tǒng)支持下維持結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定,支持與儲備系統(tǒng)則不斷的為功能系統(tǒng)的細胞更新和功能活動提供細胞源泉和細胞活動所需的營養(yǎng)物質(zhì)。功能系統(tǒng)是以功能細胞的專能特化為特點,而作為支持與儲備系統(tǒng)的筋膜支架是以干細胞為核心,通過向各種定向干細胞分化,不斷為功能系統(tǒng)的更新提供細胞補充,并為功能系統(tǒng)的各種細胞的更新、代謝提供了

3、一個穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境。大強度的運動,機體筋膜中的儲備被快速耗竭,機體的支持儲備系統(tǒng)補充不足,可導(dǎo)致機體疲勞提前產(chǎn)生,耐力不足。如何保持筋膜的正常狀態(tài),為功能系統(tǒng)提供穩(wěn)定的細胞來源并維持其向功能細胞的正常分化,是延緩或消除疲勞的關(guān)鍵。如果過度消耗的干細胞能得到及時補充,為機體提供新的細胞儲備,不僅可延緩運動疲勞的產(chǎn)生和消除疲勞,而且還可以提高運動員的運動壽命。
　　 脂肪源干細胞(adipose-derived.stem cells,

4、ADSCs)是指筋膜脂肪組織中具有干細胞特性的細胞群,是從筋膜結(jié)締組織中獲取的一類具有多向分化潛能的成體干細胞。Zuk等首次從人的脂肪組織懸液中分離出了可以在體外穩(wěn)定增殖、具有多向分化能力的脂肪組織提取細胞(processed lipoaspirate cells,PLA細胞)。與其它成體干細胞比較,PLA細胞具有來源廣泛、取材方便,創(chuàng)傷小且不存在免疫排斥反應(yīng)等優(yōu)點,實驗證明ADSCs具有跨胚層的多向分化潛能。可作為干細胞資源通過分化對

5、功能細胞進行補充,也可刺激機體分泌各種因子,促進機體的損傷修復(fù)。在誘導(dǎo)作用下,它可以分化成中胚層來源的脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、心肌細胞,外胚層來源的神經(jīng)細胞,也可以分化成內(nèi)胚層來源的內(nèi)皮細胞,及肝細胞等。
　　 力竭游泳運動訓(xùn)練造成的運動疲勞模型是國內(nèi)外比較公認的模型。在一定時間內(nèi)連續(xù)對大鼠進行游泳訓(xùn)練,進行力竭游泳,使大鼠處于一種運動疲勞狀態(tài)。長期運動疲勞的大鼠,機體代謝失衡。反映機體運動能力的一些指標發(fā)生顯著變化,如肌

6、糖原、肝糖原含量急劇下降,血液中的血紅蛋白(Hb)含量下降,血清尿素(BUN)、乳酸脫氫酶(LDH)、血乳酸(BLa)等和運動能力負相關(guān)的指標顯著升高。反映肝臟狀態(tài)的指標如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)活性含量也發(fā)生顯著變化。
　　 本實驗通過觀察一些與運動疲勞相關(guān)的血液生化指標的變化,肌糖原、肝糖原含量的變化,反映骨骼肌狀態(tài)的指標的變化,骨骼肌的變化,以及力竭游泳時間的變化,來探

7、討外源性脂肪源干細胞移植是否具有延緩或消除運動疲勞的作用,探索一種新的抗運動疲勞機制,為提高機體運動能力延長運動壽命提供新的思路和方法,進而為筋膜學(xué)說提供實驗佐證。
　　 目的:通過觀察同種異體移植脂肪源干細胞對力竭游泳導(dǎo)致大鼠運動疲勞相關(guān)血液生化指標,反映肝臟狀態(tài)的指標,骨骼肌,以及力竭游泳時間的變化的影響,來探討外源性脂肪源干細胞移植是否具有延緩或消除運動疲勞的作用,進一步為筋膜結(jié)締組織作為機體的干細胞儲備源泉提供證據(jù)支持,

8、為筋膜學(xué)提供理論支撐。
　　 1.通過對非特異性筋膜結(jié)締組織分離培養(yǎng),觀察非特異性筋膜結(jié)締組織中是否存在脂肪源干細胞；
　　 2.觀察移植脂肪源干細胞對力竭游泳大鼠的血清尿素(BUN)、乳酸脫氫酶(LDH)、血乳酸(BLa)和血紅蛋白(Hb)含量影響,探討其血清學(xué)意義；
　　 3.觀察移植脂肪源干細胞對力竭游泳大鼠的反映肝臟狀態(tài)的指標如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)

9、活性含量以及肝糖原的含量影響。
　　 4.觀察移植脂肪源干細胞對力竭游泳大鼠的肌糖原、骨骼肌以及力竭游泳時間的變化的影響。通過免疫組織化學(xué)染色,觀察移植標記的脂肪源干細胞在骨骼肌組織中的定位和移位情況。
　　 方法
　　 1.取3個月齡Wistar大鼠腹股溝脂肪墊,酶消化法分離、培養(yǎng)脂肪源干細胞。通過形態(tài)學(xué)、功能學(xué)、流式細胞術(shù)鑒定所分離、培養(yǎng)的細胞是否具有間充質(zhì)干細胞的特性,來判斷非特異性筋膜結(jié)締組織中是否具有間

10、充質(zhì)干細胞。
　　 2.40只Wistar雄性大鼠隨機分成安靜對照組(A空白對照組)、游泳訓(xùn)練照組(B模型組)、安靜移植細胞組(C實驗對照組)和游泳移植細胞組(D實驗組)。模型組和實驗組進行力竭游泳訓(xùn)練。
　　 3.大鼠適應(yīng)性游泳訓(xùn)練一周后,實驗組與實驗對照組經(jīng)尾靜脈輸入ADSCs。用于移植的第4代ADSCs在進行傳代后,在培養(yǎng)基中加入10μmol/L的Brdu,培養(yǎng)3天后消化收集,無菌生理鹽水重懸,200萬/ml。每只

11、大鼠經(jīng)尾靜脈注射ADSCs2×106個,模型組輸入生理鹽水1ml。模型組和實驗組繼續(xù)完成訓(xùn)練計劃。
　　 4.游泳訓(xùn)練計劃結(jié)束后,4組大鼠均于第27d開始進行力竭游泳,記錄力竭時間；然后水合氯醛麻醉大鼠,心臟取血,部分備用檢測Hb,其余室溫下放置8h后3000r/min,離心15min制備血清,檢測BUN、BLa、LDH；取肝臟以及股四頭肌,迅速凍存到-80℃冰箱,以備檢測；取大鼠腓腸肌,多聚甲醛固定,以備組織化學(xué)檢測。

12、　　 結(jié)果
　　 1.脂肪源干細胞具有長梭形、多角形的形態(tài)學(xué)特征,可以形成細胞集落。細胞表面標記物檢測,細胞具有間充質(zhì)干細胞特性。體外誘導(dǎo)可以分化成脂肪細胞、成肌細胞、成骨細胞。
　　 2.力竭游泳訓(xùn)練可以導(dǎo)致大鼠運動疲勞,模型組與空白對照組比較,肝糖原、肌糖原、Hb水平顯著降低,血清BUN、LDH、BLa水平均顯著升高,肝臟中超氧化物歧化酶(SOD)水平降低、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)變化不明顯、而丙二醛(M

13、DA)含量升高(P<0.01)。移植ADSCs后,運動疲勞大鼠實驗組與模型組比較,實驗組肝糖原、肌糖原、Hb、SOD、GSH-PX顯著提高(P<0.01),而BUN、LDH、BLa、MDA水平均明顯降低(P<0.01)。
　　 3.經(jīng)過游泳訓(xùn)練后,大鼠的力竭時間,模型組與空白對照組比較,力竭時間顯著延長(P<0.01)；與模型組比較,實驗組力竭時間有較大提高(P<0.01)。
　　 結(jié)論
　　 1.光學(xué)顯微鏡下觀

14、察:可見細胞形態(tài)均一,呈多角形或者長梭形。表型鑒定:3代ADSCs流式細胞儀表面抗原檢測結(jié)果顯示,CD29-APC呈強陽性,陽性率達到99％以上；CD90-FITC也呈陽性,陽性率可達到95％；而CD11b/c-APC、CD45-PE、CD106-PE、CD49d-FITC呈陰性,陰性率均達到90％以上。綜上可以得出在成年大鼠的筋膜結(jié)締組織中存在未分化間充質(zhì)干細胞的結(jié)論。
　　 2.通過對大鼠的指標檢測以及行為觀察,力竭游泳訓(xùn)練

15、導(dǎo)致運動疲勞模型成功。
　　 3.靜脈移植脂肪源干細胞,可以顯著升高運動疲勞大鼠血液中Hb的含量,有效降低BUN、LDH、BLa含量。
　　 4.靜脈移植脂肪源干細胞,可以顯著升高運動疲勞大鼠肝臟中肝糖原、SOD、GSH-PX含量,有效降低MDA含量。
　　 5.靜脈移植脂肪源干細胞,可以有效改善了運動疲勞大鼠的力竭游泳時間。
　　 綜上所述,本研究分別采用了細胞分離培養(yǎng)、免疫組化學(xué)、行為學(xué)等技術(shù)手段,從