骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植合并深低溫凍儲(chǔ)對(duì)大鼠同種異體氣管移植的作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　 臨床上經(jīng)常遇到因先天性疾病、炎癥、腫瘤、或其它因素引起的廣泛氣管病變而需要進(jìn)行節(jié)段切除和氣管重建。疾病導(dǎo)致氣管節(jié)段切除后端端吻合的安全長(zhǎng)度為成人1/2、小兒1/3的氣管長(zhǎng)度。超過(guò)此長(zhǎng)度時(shí),如何修復(fù)缺損氣管是國(guó)內(nèi)外胸外科的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問(wèn)題。關(guān)于氣管替代物的研究有許多嘗試,包括同種異體氣管、非氣管的自體組織(如小腸)和人工氣管假體(如金屬支架)等。近年來(lái)組織工程化氣管的研究,包括支架(生物材料)和種子細(xì)胞的選擇、移植物再

2、血管化和上皮再生等方面取得了一些進(jìn)展。但是,由于氣管的特殊的生理特點(diǎn)和功能需要,目前仍未找到理想的組織工程化氣管,因而同種異體氣管仍然是臨床上的首選。對(duì)于供體氣管的儲(chǔ)存,移植后的免疫排斥反應(yīng)的抑制,移植氣管的上皮再生和再血管化是臨床應(yīng)用前亟待解決的難題。
　　 本博士論文的設(shè)計(jì)旨在解決以上的難題,對(duì)如何儲(chǔ)存供體氣管,降低異體氣管的免疫原性,促進(jìn)移植氣管的上皮再生和再血管化進(jìn)行了研究。我們應(yīng)用靜脈移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞合并深低溫處理

3、供體氣管進(jìn)行同種異體氣管移植,探討深低溫處理對(duì)于減輕移植后的免疫排斥反應(yīng)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在促進(jìn)移植氣管上皮和新生血管生成中的作用,為將來(lái)的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 材料和方法:
　　 一、大鼠深低溫同種異體氣管移植動(dòng)物模型的建立及凍儲(chǔ)2 wk和6 wk氣管移植的比較
　　 (一)實(shí)驗(yàn)材料
　　 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　 清潔級(jí)Wistar大鼠,體重280～300 g,分別作為大鼠同種異體氣管移植的

4、供體和受體。
　　 2、主要試劑
　　 冷凍保護(hù)劑(DMEM培養(yǎng)基,胎牛血清,二甲基亞砜,蔗糖,青霉素,鏈霉素,二性霉素B),水合氯醛
　　 3、主要儀器
　　 超凈工作臺(tái);液氮罐;手術(shù)器械;光學(xué)顯微鏡;電子顯微鏡。
　　 (二)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組
　　 雌性Wistar大鼠,由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。作為氣管移植供體的大鼠14只,每只大鼠可提供2個(gè)8～10個(gè)氣管環(huán)的供體氣管。作為氣管移植

5、受體的大鼠40只,隨機(jī)編號(hào)分為4組,即分別移植深低溫2 wk和6 wk氣管的實(shí)驗(yàn)組(cryopreserved allograft,ALLO-2wk and ALLO-6wk),以及新鮮自體氣管移植(fresh autograft,AUTO-control)和新鮮(未經(jīng)深低溫處理)異體氣管移植(freshallograft,ALLO-control)的對(duì)照組。各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物擬于移植后的第1、4和8周各處死4只。但新鮮異體氣管移植的大鼠(N

6、=4)均在3天內(nèi)死亡,ALLO-2wk大鼠(N=12)均在10天內(nèi)死亡。
　　 (三)實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、預(yù)先取供體氣管8～10個(gè)氣管環(huán)置入裝有冷凍保護(hù)劑的凍存管中,4℃冷平衡4 hr后置入-80℃24 hr,取出后投入液氮中儲(chǔ)存至2 wk和6 wk。
　　 2、受體大鼠麻醉后,切除頸段2～3個(gè)氣管環(huán),將復(fù)溫后的供體氣管經(jīng)末端修剪后剩余6～8個(gè)氣管環(huán),以端端吻合方式與受體大鼠的斷端氣管吻合,并用頸部肌肉包裹吻合部

7、位,建立同種異體氣管移植動(dòng)物模型。
　　 3、觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法
　　 (1)觀察術(shù)后受體存活時(shí)間。
　　 (2)光鏡和電鏡觀察移植物吻合口附近氣管生長(zhǎng)和再生情況。
　　 二、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)、鑒定及標(biāo)記
　　 (一)實(shí)驗(yàn)材料
　　 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　 清潔級(jí)Wistar大鼠,4-5周齡,體重60～80g,BMSCs培養(yǎng)原代取材使用。
　　 2、主要試劑

8、　　 DMEM低糖培養(yǎng)基,成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液;成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)液;茜草素紅;油紅0;
　　 3、主要儀器
　　 超凈工作臺(tái);二氧化碳培養(yǎng)箱;倒置顯微鏡;低溫離心機(jī)。
　　 (二)實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs。
　　 2、體外誘導(dǎo)方法鑒定BMSCs分化能力。
　　 3、測(cè)定BMSCs生長(zhǎng)曲線(xiàn),評(píng)估BMSCs體外生長(zhǎng)能力。
　　 4、應(yīng)用成脂肪和成骨誘導(dǎo)進(jìn)行BMSC

9、的鑒定。
　　 5、當(dāng)細(xì)胞傳到3～5代時(shí),收集離心沖洗,并用PKH-26熒光進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記。
　　 6、觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法
　　 (1)在倒置顯微鏡下觀察BMSCs的細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
　　 (2)在倒置熒光顯微鏡下觀察BMSCs的熒光標(biāo)記情況
　　 三、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植合并深低溫凍儲(chǔ)對(duì)大鼠同種異體氣管移植上皮再生和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)的影響
　　 (一)實(shí)驗(yàn)材料
　　

10、1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　 清潔級(jí)Wistar大鼠,體重280～300g,分別作為大鼠同種異體氣管移植的供體和受體;另取4～5周齡,體重60～80g,BMSCs培養(yǎng)原代取材使用。
　　 2、主要試劑
　　 DMEM低糖培養(yǎng)基,冷凍保護(hù)劑,抗VEGF抗體
　　 3、主要儀器
　　 超凈工作臺(tái);二氧化碳培養(yǎng)箱;倒置顯微鏡;低溫離心機(jī);液氮罐;手術(shù)器械;電子顯微鏡。
　　 (二)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組
　

11、　 雌性Wistar大鼠72只,由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。作為氣管移植供體的大鼠24只,每只大鼠可提供2個(gè)8～10個(gè)氣管環(huán)的供體氣管。作為氣管移植受體的大鼠48只,隨機(jī)分為4組,給予異體深低溫凍儲(chǔ)2 wk和6 wk的氣管移植后,通過(guò)鼠尾靜脈注射BMSCs的實(shí)驗(yàn)組(BMSC-2wk;BMSC-6wk)和注射PBS的對(duì)照組(PBS-2wk;PBS-6wk),各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別擬于移植后的第1、4和8周各處死4只。
　　 (三)實(shí)

12、驗(yàn)方法
　　 用深低溫凍儲(chǔ)2 wk和6 wk的氣管進(jìn)行同種異體氣管的移植后,用PKH-26標(biāo)記后的3～5代BMSCs經(jīng)鼠尾靜脈移植入受體內(nèi),用等量的PBS注射作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。觀察供體氣管的組織學(xué),上皮爬行和新生血管情況;局部PKH-26熒光檢測(cè)和VEGF蛋白水平來(lái)評(píng)價(jià)BMSC對(duì)移植氣管的新生上皮和新生血管作用的效果。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 一、大鼠深低溫同種異體氣管移植動(dòng)物模型的建立及凍儲(chǔ)2 wk和6 wk氣管移

13、植的比較
　　 新鮮自體氣管移植(對(duì)照,AUTO-control)組的氣管術(shù)后1、4和8wk觀察結(jié)果:移植氣管結(jié)構(gòu)完整,管腔內(nèi)為假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮所覆蓋,軟骨無(wú)變性壞死;術(shù)后能長(zhǎng)期存活。新鮮異體氣管移植(對(duì)照,ALLO-control)組的大鼠均于術(shù)后3天內(nèi)因氣管管腔塌陷,移植氣管壞死而死亡。深低溫凍儲(chǔ)2周(ALLO-2wk)組的大鼠均于術(shù)后10天內(nèi)死亡。其中4只于1wk時(shí)按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)處死,其余8只分別于術(shù)后5d(N=1)、6d(

14、N=2)、8d(N=3)和10d(N=2)時(shí)因氣管管腔塌陷,移植氣管壞死而死亡。顯微鏡下見(jiàn)移植氣管內(nèi)有大量淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的浸潤(rùn)。深低溫凍儲(chǔ)6周(ALLO-6wk)組的大鼠的移植氣管上皮形態(tài)上與自體氣管移植組相比,其復(fù)層上皮厚度明顯變薄或成單層,但未見(jiàn)有單核細(xì)胞浸潤(rùn),可長(zhǎng)期存活。其中有8只分別于術(shù)后1wk(N=4)和4wk(N=4)時(shí)按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)處死,其余4只分別于術(shù)后14d(N=1)、18d(N=1)、30d(N=1)和35d(N=1

15、)時(shí)因肉芽增生,氣管管腔狹窄而死亡。
　　 二、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)、鑒定及標(biāo)記
　　 1、倒置顯微鏡下觀察到體外培養(yǎng)的原代BMSCs48 hr內(nèi)可見(jiàn)有少量貼壁細(xì)胞,貼壁的BMSC細(xì)胞呈圓形,成纖維細(xì)胞樣或紡錘體樣,12 d后能夠達(dá)到90％融合;熒光顯微鏡下見(jiàn)幾乎所有BMSCs均已被標(biāo)記紅色熒光。
　　 2、用茜草素紅和油紅0分別對(duì)向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)的BMSCs進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn)各自向誘導(dǎo)的細(xì)胞分化,光鏡

16、下觀察有紅色的骨基質(zhì)的沉積和脂滴形成。
　　 三、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植合并深低溫凍儲(chǔ)對(duì)大鼠同種異體氣管移植上皮再生和VEGF表達(dá)的影響
　　 1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植合并深低溫凍儲(chǔ)后的移植氣管結(jié)構(gòu)完整,組織學(xué)檢查管腔內(nèi)為假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮所覆蓋,軟骨無(wú)變性壞死;術(shù)后均能長(zhǎng)期存活。PBS對(duì)照組中,深低溫6 wk的移植氣管(PBS-6wk)上皮再生情況優(yōu)于2 wk(PBS-2wk),PBS-6wk實(shí)驗(yàn)大鼠最長(zhǎng)存活35d,PB

17、S-2wk實(shí)驗(yàn)大鼠最長(zhǎng)存活10d;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植組中,BMSC-6wk實(shí)驗(yàn)大鼠能存活到8wk(12只大鼠分別按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在1wk、4wk、8wk時(shí)處死),BMSC-2wk實(shí)驗(yàn)大鼠中有一例能存活到8wk(8只大鼠分別按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在1wk和4wk時(shí)處死,1只在8wk按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)處死),其余3只分別于30,32和42d時(shí)死亡。移植物上皮再生情況無(wú)明顯差別。
　　 2、PKH-26標(biāo)記的BMSCs在氣管組織定植后呈現(xiàn)紅色熒光。術(shù)后1wk

18、即可見(jiàn)受體氣管吻合口處組織有紅色熒光標(biāo)記,術(shù)后4wk和8wk仍可見(jiàn)受體氣管和移植氣管處有紅色熒光標(biāo)記,其中以吻合口處熒光標(biāo)記較多。各時(shí)間段遠(yuǎn)離吻合口的受體氣管基本未見(jiàn)紅色熒光標(biāo)記物。表明BMSCs經(jīng)靜脈移植后,可向損傷的氣管組織遷移并定位,而且可隨移植氣管的血管化逐漸由受體氣管切緣向移植氣管遷移,最后可定位于移植段氣管。
　　 3、免疫組織化學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)VEGF蛋白在氣管上皮內(nèi)有陽(yáng)性表達(dá),術(shù)后1wk的氣管標(biāo)本中,BMSCs移植組的

19、上皮細(xì)胞表達(dá)VEGF水平高于PBS對(duì)照組。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植組術(shù)后1wk、4wk和8wk的氣管標(biāo)本中,BMSC-2wk和BMSC-6wk的移植氣管VEGF水平無(wú)明顯差別。
　　 結(jié)論:
　　 1、移植經(jīng)深低溫冷凍的異體氣管的大鼠存活時(shí)間明顯長(zhǎng)于新鮮異體氣管移植組。其中,ALLO-6wk組的大鼠存活時(shí)間,移植氣管的上皮再生情況要優(yōu)于ALLO-2wk,表明深低溫冷凍6wk后的氣管,其免疫原性低于深低溫冷凍2wk的氣管。