脂肪源性干細(xì)胞對大鼠陰道粘膜下脫細(xì)胞心包膜移植物的影響.pdf

1、【研究背景】
　　女性盆底功能障礙性疾?。≒elvic floor dysfunctional diseases，PFD）的發(fā)病率逐年升高，是中老年婦女的常見疾病，經(jīng)產(chǎn)婦有將近50％會(huì)發(fā)生盆腔臟器脫垂（Pelvic organ prolapse，POP）。隨著世界各國特別是發(fā)達(dá)國家人口老齡化日趨嚴(yán)重，盆底功能障礙性疾病越來越引起人們的重視。女性POP患者中11%需要手術(shù)治療，并且30%需要再次手術(shù)。為降低POP術(shù)后復(fù)發(fā)率，運(yùn)用合成

2、補(bǔ)片及生物補(bǔ)片對盆底進(jìn)行修復(fù)逐漸增加。
　　聚丙烯網(wǎng)片是合成補(bǔ)片的代表，采用聚丙烯網(wǎng)片的全盆底重建手術(shù)術(shù)后治愈率明顯高于傳統(tǒng)手術(shù)，但由于人工合成網(wǎng)片的盆底重建手術(shù)存在術(shù)后陰道壁柔軟性差、網(wǎng)片的侵蝕率高(2%-29%)，以及性交痛等相關(guān)并發(fā)癥。而采用生物補(bǔ)片的全盆底重建手術(shù)具有較好的生物相容性，術(shù)后陰道壁柔軟性較好、補(bǔ)片侵蝕率低、并發(fā)癥少等，且植入人體后的降解周期與誘導(dǎo)周圍組織再生能力的矛盾影響其遠(yuǎn)期治療效果。因此，應(yīng)用組織工程學(xué)方

3、法構(gòu)建組織工程補(bǔ)片，利用干細(xì)胞在體內(nèi)的增殖、分化潛能，使盆底組織再生，有望提高生物補(bǔ)片的遠(yuǎn)期療效。種子細(xì)胞的選擇是組織工程學(xué)的關(guān)鍵。脂肪源性干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）來源于脂肪組織，具有多項(xiàng)分化潛能、促進(jìn)組織生長、旁分泌及免疫調(diào)節(jié)等功能。區(qū)別于胚胎干細(xì)胞與骨髓源性干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs），ADSCs具有如下優(yōu)點(diǎn)：

4、　　1）取材方便，來源豐富；
　　2）無倫理問題；
　　3）體外培養(yǎng)擴(kuò)增容易；
　　4）分化能力與年齡無關(guān)。
　　ADSCs作為種子細(xì)胞，是構(gòu)建組織工程補(bǔ)片的最佳選擇。
　　本課題利用大鼠ADSCs載入生物補(bǔ)片，構(gòu)建大鼠ADSCs-生物補(bǔ)片復(fù)合物，體外實(shí)驗(yàn)檢測其生物相容性，并將復(fù)合物植入大鼠陰道粘膜下組織中，觀察大鼠ADSCs對不同的生物材料在局部組織中的炎性反應(yīng)、血管生成、膠原合成的影響，為盆腔器官脫垂手

5、術(shù)新型的生物組織工程學(xué)材料的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　【研究目的】
　　1.大鼠ADSCs載入脫細(xì)胞豬心包膜（acellular porcine pericardium，APP）和脫細(xì)胞牛心包膜（acellular bovine pericardium，ABP）形成新型的組織工程補(bǔ)片，觀察APP和ABP與大鼠ADSCs在體外的生物相容性。
　　2.構(gòu)建大鼠陰道粘膜下植入ECM模型，橫向比較APP和ABP在體內(nèi)的生物相容性

6、，觀察ADSCs對APP和ABP植入局部組織的炎性反應(yīng)、血管生成及膠原合成的影響，探討新型的干細(xì)胞-生物補(bǔ)片復(fù)合材料用于盆腔器官脫垂手術(shù)的可行性。
　　【研究方法】
　　1.取雌性大鼠（180±20g）腹股溝脂肪墊，經(jīng)過酶消化分離獲取ADSCs。第3代ADSCs懸液，滴注在APP和ABP的漿膜層和纖維層，培養(yǎng)7天后，掃描電鏡觀察ADSCs的生長狀況。
　　2.構(gòu)建雌性去勢大鼠（200±20g）陰道粘膜下補(bǔ)片植入模型。將

7、脫細(xì)胞豬和牛心包膜、復(fù)合ADSCs的脫細(xì)胞豬和牛心包膜植入大鼠陰道粘膜下，在SPF級條件下飼養(yǎng)30天。大鼠處死后取材，進(jìn)行HE染色、Masson三色染色及CD34免疫組織染色，分析炎癥反應(yīng)、膠原含量及新生血管數(shù)量的變化。
　　【結(jié)果】
　　1.脫細(xì)胞豬和牛心包膜的微觀結(jié)構(gòu)：掃描電鏡顯示，APP纖維層纖維絲細(xì)微，呈小股結(jié)合，散開分布，表面參差不平，高低落差明顯。ABP纖維層纖維絲結(jié)股，并行排列，結(jié)構(gòu)致密，表面較平整。APP漿膜

8、層纖維絲結(jié)成致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)孔細(xì)小，表面平滑。ABP的堅(jiān)韌與微觀結(jié)構(gòu)所見一致。ABP漿膜層與APP類似。
　　2. ADSCs在兩種AP上的形態(tài)及分布特征：ADSCs載入APP和ABP體外培養(yǎng)1天后，掃描電鏡下見APP和ABP表面均有大量ADSCs粘附和增殖，ADSCs形態(tài)大部分呈紡錘體樣，少量呈成纖維細(xì)胞樣，部分融合生長；ADSCs載入APP和ABP體外培養(yǎng)7天后，ADSCs形態(tài)大部分已呈成纖維細(xì)胞樣，細(xì)胞膜突觸豐富，伸出偽足

9、爬行于材料表面，大部分ADSCs融合生長。APP與ABP的漿膜層表面平滑，而ABP的纖維層較平整，ADSCs呈水平分布。APP的纖維層，ADSCs細(xì)胞隨纖維絨毛散在、落差分布。
　　3.成功構(gòu)建雌性去勢大鼠陰道粘膜下生物補(bǔ)片植入模型。該模型構(gòu)建方法簡易，成模率高，達(dá)100%，未見感染、血腫、排斥等并發(fā)癥。
　　4.建模后飼養(yǎng)30天后，大體標(biāo)本觀察：補(bǔ)片無侵蝕及攣縮，透過陰道粘膜仍可見植入的AP形態(tài)完整，觸摸補(bǔ)片植入局部組織柔

10、軟度APP比ABP更佳，而ABP材料堅(jiān)韌，異物感明顯。兩種AP材料周圍均可見結(jié)締組織包被。
　　5.建模后飼養(yǎng)30天后，標(biāo)本組織學(xué)分析：
　　5.1、HE染色：除對照組外，各組材料周圍可見纖維結(jié)締組織包被，均可見炎癥細(xì)胞浸入，且炎癥細(xì)胞以淋巴細(xì)胞為主，少量成纖維細(xì)胞，偶可見中性粒細(xì)胞。
　　5.2、各組間巨噬細(xì)胞及異物巨細(xì)胞計(jì)數(shù)的比較：APP組、ABP組、APP+ADSCs組與ABP+ADSCs組巨噬細(xì)胞及異物巨細(xì)胞計(jì)

11、數(shù)分別為：13.85±6.04/5HPFs、5.84±3.27/5HPFs、4.08±3.05/5HPFs、1.15±0.64/5HPFs。APP組與ABP組、APP組與APP+ADSCs組、ABP組與ABP+ADSCs組比較，局部炎癥細(xì)胞浸潤明顯增加，巨噬細(xì)胞及異物巨細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增加，材料降解明顯（P<0.05）。APP組與ABP組比較，APP組炎癥細(xì)胞浸潤明顯高于ABP組，巨噬細(xì)胞及異物巨細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增加，APP較ABP降解更明顯（

12、P<0.05）。
　　5.3、各組間血管密度的比較：APP組、ABP組、APP+ADSCs組與ABP+ADSCs組CD34免疫組化染色血管密度分別為：6.15±1.48/5HPFs、8.0±2.755/HPFs、6.2±1.585/HPFs、6.4±1.40/5HPFs。各組間血管密度無顯著差異（P>0.05）。
　　5.4、各組間膠原含量的比較：Masson三色染色APP組可見圖片中大量紅色，綠色膠原含量明顯減少，APP組

13、、ABP組、APP+ADSCs組與ABP+ADSCs組膠原含量分別為：0.127±0.014mm2、0.169±0.012mm2、0.151±0.003mm2、0.161±0.017mm2。APP組與ABP組及APP+ADSCs組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。ABP組與ABP+ADSCs比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　【結(jié)論】
　　1.大鼠陰道粘膜下植入ECM模型，操作簡易，成模率高，是研究盆底重建手術(shù)輔助