氟誘導(dǎo)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡及機(jī)制研究.pdf

1、目的:氟(Flurine)是一種非金屬元素,也是人體必需的一種微量元素。氟具有強(qiáng)大的電負(fù)性,以氟化物(Fluoride)的形式廣泛存在于自然界中。攝入適量的氟有利于機(jī)體預(yù)防齲齒、維持鈣磷代謝和保持神經(jīng)沖動傳導(dǎo),而過量的氟化物則對機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的毒性作用,能引起機(jī)體多系統(tǒng)損害。過去,人們多以氟對骨相組織的損害為研究重點(diǎn),但近年來,隨著氟化物在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生活中的廣泛應(yīng)用,氟對機(jī)體生殖系統(tǒng)等非骨相組織的毒性作用逐漸被人們所重視。因此,關(guān)于氟致

2、雄性生殖毒性的研究日益受到關(guān)注。
　　 本課題通過動物體內(nèi)和體外兩部分實(shí)驗(yàn),研究氟中毒對睪丸組織及間質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響。通過建立氟中毒小鼠模型,研究對小鼠睪丸組織損傷和細(xì)胞凋亡的影響；建立并優(yōu)化睪丸間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)條件與方法,觀察不同凍存復(fù)蘇條件對細(xì)胞生物學(xué)特性的影響；觀察不同濃度氟化鈉對睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的影響及其相關(guān)蛋白表達(dá),為氟中毒的機(jī)制研究提供依據(jù)。
　　 方法:
　　 (1)體內(nèi)實(shí)驗(yàn):動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用

3、給小鼠飲用含0,10,25,50mg／L氟化鈉的加氟水,制作動物中毒模型,觀察動物臨床表現(xiàn)及病理切片,研究氟對睪丸組織的損傷,并用原位細(xì)胞凋亡標(biāo)記技術(shù),末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL法)檢測小鼠睪丸細(xì)胞凋亡的變化。
　　 (2)體外實(shí)驗(yàn):采用2種酶消化法分離純化睪丸間質(zhì)細(xì)胞并尋求較適宜的培養(yǎng)條件,原代培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)傳代、凍存與復(fù)蘇,倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。取體外培養(yǎng)的睪丸間質(zhì)細(xì)胞,胰酶消化后制

4、成單細(xì)胞懸液,常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞融合率達(dá)80％,且未出現(xiàn)細(xì)胞分化時(shí),將細(xì)胞分為4組,加入不同濃度的氟化鈉染毒(0,5,10,20mg／L)睪丸間質(zhì)細(xì)胞,分別染毒0,24,48,72,96,120h后采用MTT法檢測各組細(xì)胞的增殖情況,觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。染毒48h后采用流式細(xì)胞儀AnnexinV-PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率。采用免疫組織化學(xué)法檢測氟對小鼠睪丸質(zhì)細(xì)胞的凋亡作用,檢測Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax蛋白

5、的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 (1)氟中毒能誘導(dǎo)小鼠睪丸TUNEL陽性細(xì)胞,且高氟組凋亡細(xì)胞率較對照組明顯增高。
　　 (2)膠原酶Ⅳ和0.25％胰蛋白酶限時(shí)消化能夠獲得較高存活率(>92％)的小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞；37℃、5％CO2條件下細(xì)胞生長良好,采用逐步降溫法和使用DMSO為凍存劑細(xì)胞復(fù)蘇率較高。
　　 (3)氟作用24h,48h后,20mg／L的氟對睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖率有明顯抑制作用,而5mg／L

6、和10mg／L的組沒有明顯影響；10mg／L氟作用72h后,明顯抑制睪丸間質(zhì)細(xì)胞的增殖；5,10,20mg／L各濃度氟作用96h和120h后均表現(xiàn)明顯抑制作用。
　　 (4)不同濃度氟對睪丸間質(zhì)細(xì)胞作用48h后,均可誘導(dǎo)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡。氟濃度為10mg／L時(shí),晚期凋亡率最高。氟濃度為20mg／L時(shí),早期凋亡率最高。
　　 (5)免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)表明:隨氟濃度的增加Caspase-3、Caspase-9、Bax陽性表

7、達(dá)率增加,灰度值降低,蛋白表達(dá)增強(qiáng)；Bcl-2陽性表達(dá)率降低,灰度值升高,蛋白表達(dá)減弱。
　　 結(jié)論:
　　 (1)本研究表明氟中毒可誘導(dǎo)小鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡,凋亡發(fā)生部位與病理改變明顯的部位相吻合,并且睪丸損害過程中有細(xì)胞凋亡機(jī)制參與。
　　 (2)建立了睪丸間質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)體系,為進(jìn)一步研究氟中毒提供技術(shù)方法和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 (3)氟對小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的增殖有抑制作用,誘導(dǎo)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡,并且