睪丸Leydig系細胞的富集、增殖及雄激素分泌組織構建.pdf

1、研究背景： 因創(chuàng)傷、腫瘤等造成的睪丸缺失臨床上并不少見，由于先天性疾病、環(huán)境污染、工作壓力日益加劇和人口老齡化等原因，雄激素缺乏性疾病的發(fā)病率具有逐年上升的趨勢[1，2]。針對這類疾病，目前尚無滿意的治療措施。隨著組織工程技術的不斷進步，以組織工程技術構建雄激素分泌組織，有希望為治療上述疾病提供理想的治療手段[3，4，5]。 種子細胞來源問題是困擾組織工程化雄激素分泌組織研究的瓶頸。本課題組在前期研究中已經(jīng)證實，采用差速

2、貼壁法能夠從不同種屬的雄性睪丸內(nèi)獲得高純度的成體Leydig細胞(Adult Leydig cells，ALCs)，初步地解決了工程化雄激素分泌組織研究種子細胞來源缺乏的問題。但是，Leydig系細胞(LCs Lineage)的各級細胞成分是否都能夠通過差速貼壁法獲得，目前尚不得而知。對哺乳動物而言，Leydig系細胞是一群不斷更新、具有較強的增殖能力的細胞，通過Leydig干細胞(Stem LeydigCells，SLCs)的增殖、分

3、化維持群體數(shù)目的動態(tài)穩(wěn)定[6，7]。在充分獲得具有增殖能力的Leydig系各級細胞成分前提下，實現(xiàn)Leydig細胞(LCs)大量的體外增殖培養(yǎng)，對于解決組織工程化雄激素分泌組織種子細胞來源不足的問題具有重大意義。 研究目的： 本研究擬通過對不同鼠齡大鼠經(jīng)差速貼筆法獲得的睪丸LC具體成分分析，探討差速貼壁法獲得的大鼠睪丸LC的具體細胞構成，檢驗差速貼壁法能否有效獲地得睪丸Leydig系各級細胞成分，包括具有增殖能力的SLC

4、s；探索通過優(yōu)化培養(yǎng)體系，實現(xiàn)具有增殖能力的LCs細胞亞群增殖的可行性，并驗證增殖細胞的生物學活性；通過體外構建及去勢動物回植實驗，檢驗增殖LCs作為雄激素分泌組織種子細胞的可行性，為解決組織工程化雄激素分泌組織研究中種子細胞來源不足的問題提供有效手段。 研究方法： 一.差速貼壁法分離純化不同鼠齡大鼠LCs：獲取生后7天、3周齡雄性Wister大鼠雙側睪丸，無菌去除白膜及較大的血管，用膠原酶震蕩消化和400目(Φ33μm

5、)不銹鋼濾網(wǎng)過濾，離心后貼壁培養(yǎng)2小時，棄上清并漂洗3此，加入培養(yǎng)液培養(yǎng)。 二.不同鼠齡大鼠LCs成分分析：生后7天、3周齡大鼠睪丸LCs分離后即刻進行3β-HSD免疫化學染色及流式細胞分析，鑒定和分析細胞組成。兩組大鼠睪丸LCs分離后以DMEM/F12培養(yǎng)體系進行培養(yǎng)，觀察細胞形態(tài)變化，檢測細胞增殖情況。培養(yǎng)4天后進行3β-HSD免疫化學染色及流式細胞分析，再次分析細胞組成，檢測細胞睪酮分泌能力變化。 三.優(yōu)化培養(yǎng)體系

6、對不同鼠齡大鼠LCs增殖的促進作用：生后7天、3周齡大鼠睪丸LCs分離后以優(yōu)化培養(yǎng)體系進行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中觀察細胞形態(tài)改變，MTT法及細胞計數(shù)法檢測細胞增殖能力；于細胞分離后即刻、體外培養(yǎng)4天侯分別進行3β-HSD免疫化學染色及流式細胞分析，分析細胞成分；檢測細胞睪酮分泌能力變化。 四.增殖LCs構建的雄激素分泌組織生物學活性檢測：按照移植物種類將移植鼠模型分為3組，①單純?nèi)萁M(對照組)、②LC+材料組和③增殖LC+材料組。收

7、集第一代以DMEM/F12培養(yǎng)4天的LC和優(yōu)化培養(yǎng)體系培養(yǎng)4天的增殖LC，分別以相同細胞密度接種于預制的可降解聚羥基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)生物材料支架上，4小時后移植入各對應組別動物的大網(wǎng)膜內(nèi)、附睪組織內(nèi)。觀察構建組織的形成、組織學形態(tài)、血管化程度等情況，心穿刺取血比較兩組移植鼠血清睪酮水平。 研究結果： 第一部分差速貼壁法獲得的LC細胞成分分析 采用差速貼壁法能夠獲得生后7天、3周齡大鼠睪丸LC，細胞經(jīng)

8、3β-HSD免疫化學染色及流式細胞分析，結果顯示培養(yǎng)初期(貼壁2小時)兩組細胞3β-HSD陽性率分別為5.4±1.2％、59.2±3.2％，在DMEM/F12培養(yǎng)體系內(nèi)培養(yǎng)4天后，兩組細胞3β-HSD陽性率分別為93.6±1.2％、95.4±3.2％，兩組培養(yǎng)的睪丸間質細胞均對HCG刺激有反應，在HCG作用下睪酮分泌增加。7天齡鼠睪丸間質細胞在培養(yǎng)過程中睪酮分泌能力逐漸增強，在培養(yǎng)第5天達到高峰；3周齡鼠睪丸間質細胞在培養(yǎng)第2天睪酮分泌

9、功能達到高峰，其后逐漸下降。 第二部分優(yōu)化培養(yǎng)體系對差速貼壁法分離的不同鼠齡大鼠LC增殖的促進作用 以優(yōu)化培養(yǎng)體系培養(yǎng)的不同鼠齡大鼠差速貼壁法獲得的睪丸LC均出現(xiàn)明顯的細胞增殖，培養(yǎng)過程中細胞3β-HSD陽性率升高，至原代培養(yǎng)第四天，絕大多數(shù)細胞均為3β-HSD陽性；兩組增殖細胞均有睪酮分泌，對HCG刺激均有反應，在HCG刺激下睪酮分泌能力明顯提高(P＜0.05)。7天齡鼠睪丸間質細胞在培養(yǎng)過程中睪酮分泌能力逐漸增強，在

10、培養(yǎng)第6天達到高峰；3周齡鼠睪丸間質細胞在培養(yǎng)第3天睪酮分泌功能達到高峰，其后逐漸下降。 第三部分以增殖細胞構建組織工程化雄激素分泌組織研究 增殖細胞組、單純LC組種子細胞與支架材料都能良好地復合，所構建的組織工程化雄激素分泌組織在三個月的觀察期內(nèi)能夠保持一定的體積，形態(tài)維持良好；與單純LC組比較，增殖細胞組睪酮分泌功能更加持久。 研究結論： 本研究證實差速貼壁法能夠有效獲得大鼠睪丸Leydig系細胞的各