白藜蘆醇通過(guò)抑制人和大鼠3β-HSD干擾睪丸間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生雄激素的研究.pdf

1、目的:
　　已經(jīng)有研究表明，3β-羥基類類固醇脫氫酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase，3β-HSD)是睪酮合成過(guò)程中重要的合成酶。而且近年來(lái)，對(duì)白藜蘆醇的研究十分多，特別是它能抗炎、抗癌和抗氧化等療效備受關(guān)注，但它在生殖方面的研究不多。本研究的目的是觀察白藜蘆醇是否會(huì)特異性抑制3β-HSD來(lái)減少雄激素的合成。
　　方法:
　　1、將30只SD大鼠分為3組，分別是對(duì)照組，50mg/kg和1

2、00mg/kg白藜蘆醇組，灌胃2天，通過(guò)放射性免疫方法(RIA)檢測(cè)大鼠睪酮的含量。
　　2、取18只35天齡的SD大鼠，脫臼處死大鼠取其睪丸，分離純化未成熟的睪丸間質(zhì)細(xì)胞（immature Leydig cell，ILC），通過(guò)3β-HSD染色鑒定出其純度達(dá)95％。在24孔板中鋪上分離純化后的ILC，每個(gè)孔含0.05×106個(gè)細(xì)胞。加入0.5mlDMEM∶F12培養(yǎng)基（無(wú)酚紅）作為培養(yǎng)基，再加入100μM白藜蘆醇，1ng/ml黃

3、體生成激素(luteinizing hormone，LH)和2μM下列化合物:8溴-3'，5'環(huán)腺苷（8-Bromoadenosine3'，5'-cyclic monophosphate，8BR），22R-羥膽固醇（22R-hydroxycholesterol，22R），孕烯醇酮（pregnenolone，PREG），孕酮(progesterone，P4)和雄烯二酮(androstenedione，D4)處理3小時(shí)（其中乙醇作為對(duì)照組）

4、。取培養(yǎng)基測(cè)5α-雄甾烷-3α，17β-二醇(5α-androstane-3α，17β-diol,DIOL)用放射性免疫方法(radioimmunoassay，RIA)測(cè)量。
　　3、取35天SD大鼠睪丸，制備獲取微粒體并測(cè)定其濃度。利用所制備的微粒體來(lái)檢測(cè)3β-HSD，細(xì)胞色素17α-乙烯羥化酶/20裂解酶(17α-hydroxylase/20-1yase,CYP17A1)和17β-HSD3(17β-hydroxysteroid

5、 dehydrogenase)的活性。
　　1)測(cè)定3β-HSD活性:
　　在活性測(cè)試管中加入0.2μM PREG和4000dpm[3H]PREG，0.2mM NAD+,10μg大鼠睪丸微粒體或者50μg人睪丸微粒體，反應(yīng)90分鐘，確定了白藜蘆醇的最大抑制濃度。根據(jù)白藜蘆醇的最大抑制濃度確定反應(yīng)體系:0.01-20μMPREG和4000dpm[3H]PREG，0.2mM NAD+，10μg大鼠睪丸微粒體或者50μg人睪丸微粒

6、體，白藜蘆醇(5μM或10μM)。上述體系在34C孵育1小時(shí)，之后加入2ml冰乙醚終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，氮?dú)鈸]干有機(jī)相，萃取類固醇。用薄層色譜（氯仿∶甲醇=97∶3，V/V）將類固醇分開(kāi)，并用Bioscan檢測(cè)類固醇的放射性，并計(jì)算出PREG轉(zhuǎn)化為P4的轉(zhuǎn)化率。
　　2)測(cè)定CYP17A1活性
　　在活性測(cè)試管中加入1μM P4和4000dpm[3H]P4，0.2mM NAD+，10μg大鼠睪丸微粒體或者50μg人睪丸微粒體

7、反應(yīng)90分鐘，確定了白藜蘆醇的最大抑制濃度。根據(jù)白藜蘆醇的最大抑制濃度確定反應(yīng)體系:0.01-20μM P4和4000dpm[3H]P4，0.2mM NADPH，10μg大鼠睪丸微粒體或者50μg人睪丸微粒體，白藜蘆醇（5μM或10μM）。上述體系在34℃孵育1小時(shí)，之后加入2ml冰乙醚終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，氮?dú)鈸]干有機(jī)相，萃取類固醇。用薄層色譜（氯仿∶甲醇=7∶1，V/V）將類固醇分開(kāi)，并用Bioscan檢測(cè)類固醇的放射性，并計(jì)算出P

8、4轉(zhuǎn)化為17-羥基孕酮的轉(zhuǎn)化率。
　　3)17β-HSD3活性
　　在活性測(cè)試管中加入200μM D4和4000dpm[3H]D4，0.2mM NAD+，9μg大鼠睪丸微粒體或者9μg人睪丸微粒體反應(yīng)60分鐘，確定了白藜蘆醇的最大抑制濃度。根據(jù)白藜蘆醇的最大抑制濃度確定反應(yīng)體系:0.01-20μM D4和4000dpm[3H]D4，0.2mM NADPH，9μg大鼠睪丸微粒體或者9μg人睪丸微粒體，白藜蘆醇（5μM或10μM

9、）。上述體系在34℃孵育1小時(shí)，之后加入2ml冰乙醚終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，氮?dú)鈸]干有機(jī)相，萃取類固醇。用薄層色譜（氯仿∶甲醇=97∶3，V/V）將類固醇分開(kāi)，并用Bioscan檢測(cè)類固醇的放射性，并計(jì)算出D4轉(zhuǎn)化為睪酮(testosterone，T)的轉(zhuǎn)化率。
　　結(jié)果:
　　1、白藜蘆醇會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性抑制3β-HSD的活性，從而抑制了ILC合成雄激素。
　　2、白藜蘆醇抑制大鼠3β-HSD的活性是具有濃度依賴性的，半抑制濃

10、度(halfmaximal inhibitory concentration，IC50)是3.87±0.06μM，同時(shí)白藜蘆醇也能抑制人3β-HSD的活性，IC50是8.48±0.04μM。
　　3、當(dāng)PREG作為底物時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇是競(jìng)爭(zhēng)性抑制大鼠3β-HSD的活性。白藜蘆醇可能也是競(jìng)爭(zhēng)性抑制人3β-HSD的活性。
　　4、通過(guò)白藜蘆醇急性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組、50mg/kg和100mg/kg白藜蘆醇組中大鼠血清睪酮的含量

11、分別是1.304±0.097ng/ml、0.697±0.050ng/ml和0.644±0.058ng/ml，這說(shuō)明了白藜蘆醇會(huì)降低大鼠血清中睪酮的含量。
　　5、我們發(fā)現(xiàn)100μM白藜蘆醇對(duì)大鼠和人的CYP17A1的作用十分微弱(IC50＞100μM)，并且100μM白藜蘆醇對(duì)17β-HSD3不產(chǎn)生抑制作用。
　　結(jié)論:
　　白藜蘆醇會(huì)特異性抑制人和大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞3β-HSD的活性，從而影響了睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成睪酮的功