睪丸形態(tài)雄激素分泌組織的構(gòu)建.pdf

1、一、研究背景 由于先天性疾病、環(huán)境污染、工作壓力日益加劇和人口老齡化等原因，雄激素缺乏性疾病的發(fā)病率具有逐年上升的趨[1]，遺憾的是，針對(duì)這類疾病，臨床尚無理想的治療措施。睪丸是男性的重要象征，對(duì)維持男性正常生理狀態(tài)、心理狀態(tài)都至關(guān)重要，這主要源于睪丸的兩大功能：一是生殖功能，即產(chǎn)生精子；二是維持男性第二性征，主要通過睪丸間質(zhì)細(xì)胞(Leydig cells，LC)合成并分泌雄激素來實(shí)現(xiàn)。因此，睪丸缺失和或雄激素缺乏，都將帶給男性

2、巨大的創(chuàng)傷。另外，睪丸外觀或功能異常對(duì)男性心理也會(huì)造成很大影響。因此，針對(duì)睪丸缺失和/或功能障礙，必須從外觀和功能兩方面治療。 組織工程技術(shù)的發(fā)展為重建能夠接受體內(nèi)生理性調(diào)節(jié)的雄激素分泌組織提供了可能LC分離純化技術(shù)的成熟，為細(xì)胞移植治療雄激素缺乏癥帶來了希望[2-4]。大量研究表明，LC移植后，在一定時(shí)期內(nèi)可以在受體內(nèi)產(chǎn)生雄激素，發(fā)揮補(bǔ)充替代作用，甚至某些研究已將其用于男性性功能低下患者的治療[5-8]。但這些方法在應(yīng)用中也遇

3、到很多問題：(1)雄激素分泌功能維持時(shí)間短暫。這可能與細(xì)胞移植后缺乏適宜的生長(zhǎng)載體和生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)[9-10]；(2)不能重建睪丸外觀。單純細(xì)胞移植無法形成具有一定體積和形態(tài)的睪丸組織。這些問題的存在，嚴(yán)重限制了細(xì)胞移植技術(shù)的推廣應(yīng)用，探索更符合生物學(xué)原則的治療方法將是解決這些問題的關(guān)鍵。組織工程技術(shù)為解決這一難題提供了新策略，其基本原理是將少量種子細(xì)胞經(jīng)體外擴(kuò)增后與生物載體結(jié)合，在體內(nèi)或體外構(gòu)建具有一定形態(tài)和生理功能的組織甚至器官。因此

4、，應(yīng)用組織工程技術(shù)構(gòu)建具有一定形態(tài)和功能的睪丸組織，將是研究和治療這類特殊疾病的新途徑。本課題指導(dǎo)小組在前期已成功聯(lián)合應(yīng)用復(fù)合膠原酶及差速貼壁法分離出LC并研究其培養(yǎng)體系、睪丸內(nèi)貼壁體細(xì)胞共培養(yǎng)體系并得出結(jié)論睪丸微環(huán)境對(duì)LC具有營養(yǎng)支持作用、睪丸內(nèi)貼壁體細(xì)胞同基因鼠體內(nèi)移植可構(gòu)建出雄激素分泌組織[11]；本課題將在其基礎(chǔ)上構(gòu)建具有睪丸外形的雄激素分泌組織，為雄激素缺乏、睪丸缺失性疾病提供一個(gè)更符合生理、更理想的治療方法。 二、研

5、究目的 1、對(duì)種子細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記的可行性。 2、具有分泌功能的睪丸形態(tài)雄激素分泌組織在同基因動(dòng)物體內(nèi)構(gòu)建的可行性。 三、研究?jī)?nèi)容和方法 1、取80±20克(3周齡)雄性Wister大鼠雙側(cè)睪丸，聯(lián)合應(yīng)用復(fù)合膠原酶消化及差速貼壁法，分離培養(yǎng)睪丸體細(xì)胞。 2、用Q-dot對(duì)部分睪丸體細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。。 3、取80±20克(3周齡)雄性Wister大鼠，經(jīng)陰囊去勢(shì)制備去勢(shì)鼠(等待飼養(yǎng)4周后回植)。

6、 4、取Wister大鼠功能良好的睪丸體細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)分組與有或無Medpor內(nèi)核的PLA+PGA生物支架分別復(fù)合，形成“細(xì)胞-生物材料”復(fù)合物。實(shí)驗(yàn)分組：Medpor-PGA+PLA復(fù)合支架組(n≥6)：2×107睪丸體細(xì)胞：PGA+PLA對(duì)照組(n≥6)：2x107睪丸體細(xì)胞；空白組(n≥6)：無細(xì)胞組；假手術(shù)組(n≥6：無細(xì)胞無材料組)。按分組將復(fù)合物、空載分別回植于已去勢(shì)4周的Wister大鼠陰囊內(nèi)，回植后3月、6月取材，測(cè)定

7、血清睪酮水平及移植物行大體觀察及HE組織學(xué)染色。 四、研究結(jié)果 1、體外培養(yǎng)觀察： 量子點(diǎn)易于標(biāo)記睪丸體細(xì)胞，不排出胞外，熒光發(fā)光度強(qiáng)容易觀察，體外培養(yǎng)十余天、傳代后熒光仍未觀察到衰減，證明量子點(diǎn)標(biāo)記睪丸體細(xì)胞可行。 2、體外培養(yǎng)取材后觀察： 最長(zhǎng)在體內(nèi)培養(yǎng)21周后仍能觀察到組織塊中的量子點(diǎn)紅光標(biāo)記，測(cè)血睪酮仍有激素分泌，說明標(biāo)記物可較長(zhǎng)期標(biāo)記，不會(huì)輕易丟失在體內(nèi)培養(yǎng)后標(biāo)記物也可以較長(zhǎng)期存在，不影

8、響組織塊形成、激素分泌，但紅光強(qiáng)度減弱。 3、睪丸體細(xì)胞復(fù)合睪丸形態(tài)的medpor-可降解生物材料形成的復(fù)合物回植入體內(nèi)后可形成組織塊，組織塊具有睪丸形態(tài)，并具有分泌雄激素的功能。 4、睪丸體細(xì)胞復(fù)合可降解生物材料的復(fù)合物回植入體內(nèi)后維持較高水平的雄激素分泌功能，可達(dá)六月之久認(rèn)不衰減，再次印證了用本課題組前期發(fā)現(xiàn)的方法分離的睪丸體細(xì)胞是構(gòu)建雄激素分泌組織的優(yōu)良種子細(xì)胞來源。 5、睪丸形態(tài)的復(fù)合物回植體內(nèi)在3月時(shí)我

9、們選用的材料內(nèi)核與PGA/PLA層比例是合適的，它既能維持睪丸形態(tài)，又能保證較高水平的雄激素分泌。而在更長(zhǎng)時(shí)期的體內(nèi)培養(yǎng)中材料內(nèi)核與PGA/PLA層比例還有待于進(jìn)一步摸索，總之睪丸體細(xì)胞與睪丸形態(tài)的生物材料支架復(fù)合回植體內(nèi)維持形態(tài)保持激素較高水平分泌是可行的。 五、研究結(jié)論 量子點(diǎn)作為標(biāo)記物標(biāo)記睪丸體細(xì)胞可行，可作為構(gòu)建具有雄激素分泌功能的組織工程睪丸的種子細(xì)胞的標(biāo)記物。以醫(yī)用多孔高密度聚乙烯(Medpor)為內(nèi)支撐外裹