肝郁脾虛證小鼠前額皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞功能變化及逍遙散的調(diào)節(jié)機(jī)制.pdf

1、研究背景：
　　肝郁脾虛證指由于肝氣郁結(jié)，疏泄失司，導(dǎo)致脾胃功能紊亂，出現(xiàn)肝木克脾土的情況，表現(xiàn)為消極、適應(yīng)能力低下、泄瀉、體重降低、飲食減少等?，F(xiàn)代生活節(jié)奏的加快，工作壓力、社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)、起居調(diào)攝失宜等原因，造成人們心里負(fù)荷加重，情志抑郁，氣機(jī)失于調(diào)達(dá)，而致肝郁脾虛證成為臨床的常見(jiàn)證候。隨著生物—心理—社會(huì)醫(yī)學(xué)模式的建立，肝郁脾虛證在各種疾病的發(fā)生發(fā)展中的重要作用也逐漸被認(rèn)識(shí)到，因此對(duì)于肝郁脾虛證的研究也得到了進(jìn)一步的關(guān)注。

2、　　長(zhǎng)期以來(lái)，中醫(yī)研究者們一直試圖從多系統(tǒng)、多層次、多角度來(lái)詮釋肝郁脾虛證的實(shí)質(zhì)，挖掘其臨床變化的物質(zhì)基礎(chǔ)。通過(guò)多年的研究和探索發(fā)現(xiàn)肝郁脾虛證的發(fā)生和應(yīng)激密切相關(guān)[1]，且海馬和前額皮質(zhì)是應(yīng)激過(guò)程中的易感腦區(qū)[2]。長(zhǎng)期暴露于應(yīng)激狀態(tài)下，使HPA軸脫抑制，糖皮質(zhì)激素維持在較高水平，使海馬和前額皮質(zhì)（Prefrontal cortex，PFC）腦區(qū)受損，膠質(zhì)細(xì)胞變性、錐體細(xì)胞萎縮、突觸蛋白PSD95和突觸蛋白Ⅰ表達(dá)下調(diào)，而這些改變均與PF

3、C的認(rèn)知功能損害相關(guān)[3]。
　　機(jī)體應(yīng)激可以使糖皮質(zhì)激素水平升高，同時(shí)腦中谷氨酸水平也隨之大幅升高。谷氨酸濃度和作用時(shí)限超出生理范圍，則會(huì)導(dǎo)致興奮性神經(jīng)毒性的產(chǎn)生，損傷神經(jīng)元。這就是社會(huì)應(yīng)激如致情感障礙的病理機(jī)制之一。這一機(jī)制與長(zhǎng)期應(yīng)激導(dǎo)致的星形膠質(zhì)細(xì)胞（ Astrocyte， As）損傷及興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（Excitatory Amino Acid Transporters，EAATs)功能障礙相關(guān)。研究證實(shí)[4]，突觸間隙

4、約80％～90%的興奮性氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)全部依賴 As、EAAT1和 EAAT2來(lái)完成，因此 As在維持突觸間隙谷氨酸濃度和抑制興奮性氨基酸毒性中發(fā)揮了重要作用。另外有研究表明，獲得性無(wú)助應(yīng)激可以使大鼠海馬和皮層的EAAT1和EAAT2表達(dá)顯著減少[5]。綜上所述，長(zhǎng)期應(yīng)激可致As損傷及EAATs功能障礙，不能對(duì)應(yīng)激誘導(dǎo)的突觸間隙中谷氨酸進(jìn)行抑制，誘發(fā)興奮性氨基酸毒性，破壞神經(jīng)元可塑性。研究發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激可導(dǎo)致動(dòng)物前額皮質(zhì)區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞密度降

5、低[6]，另外有研究表明慢性不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激可使小鼠前額皮質(zhì)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（ glial fibrillary protein，GFAP）蛋白表達(dá)減少[7-9]。膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目和形態(tài)的改變與膠質(zhì)細(xì)胞功能損傷可能互為因果，且應(yīng)激又可導(dǎo)致 GFAP表達(dá)減少。從而提示前額皮質(zhì)區(qū)星形膠質(zhì)功能受損可能參與長(zhǎng)期慢性應(yīng)激導(dǎo)致的肝郁脾虛證的發(fā)生，但是關(guān)于肝郁脾虛證的這一機(jī)制研究目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。
　　研究目的：
　　本研究對(duì)長(zhǎng)期慢性復(fù)合應(yīng)激誘

6、導(dǎo)的肝郁脾虛證小鼠前額皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸調(diào)節(jié)功能變化及逍遙散的治療機(jī)制進(jìn)行了研究，以期為肝郁脾虛證的實(shí)質(zhì)和其生物學(xué)內(nèi)涵的詮釋奠定基礎(chǔ)，為肝郁脾虛證的治療尋找新的藥物作用靶點(diǎn)。
　　研究方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)選用成年C57BL/6J雄性小鼠80只，10周齡，隨機(jī)分為正常組，模型組，逍遙散組和氟西汀組，每組20只。正常組5只1籠，其余3組單籠孤養(yǎng)。
　　2.適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，除正常組外，其余各組小鼠均以復(fù)合應(yīng)激方法制作2

7、1天肝郁脾虛證小鼠模型，同時(shí)模型組、逍遙散組和氟西汀組小鼠分別進(jìn)行生理鹽水、逍遙散和氟西汀灌胃干預(yù)。
　　3.對(duì)小鼠體重、攝食量及宏觀表征進(jìn)行觀察和記錄。
　　4.以曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)、新環(huán)境抑制進(jìn)食實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和糖水實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠的行為學(xué)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　5.比色法檢測(cè)小鼠血清D-木糖含量的改變。
　　6.HE染色觀察小鼠前額皮質(zhì)病理改變。
　　7.ELISA方法檢測(cè)小鼠前額皮質(zhì)bFGF、TGF-

8、β1、BDNF和NGF的含量。
　　8.比色法檢測(cè)小鼠前額皮質(zhì)谷氨酸（Glu）濃度。
　　9.Western Blot和免疫組化方法檢測(cè)小鼠前額皮質(zhì)GFAP、NeuN、EAAT1和EAAT2蛋白的表達(dá)。
　　10.Quantitative Real-time PCR（qPCR）方法檢測(cè)小鼠前額皮質(zhì)中的GFAP、NeuN、EAAT1和EAAT2基因的表達(dá)。
　　11.尼氏染色觀察小鼠前額皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)和數(shù)目。

9、>　　研究結(jié)果：
　　1.各組小鼠一般情況比較：模型組小鼠表現(xiàn)由易怒轉(zhuǎn)變?yōu)榈吐?，毛發(fā)凌亂無(wú)光澤，扎堆少動(dòng)，灌胃抵抗弱，便溏。氟西汀組和逍遙散組上述反應(yīng)較輕，而正常組未見(jiàn)明顯異常表現(xiàn)。各組小鼠體重增長(zhǎng)存在顯著差（P＜0.01），模型組和逍遙散組小鼠體重增長(zhǎng)緩慢（P＜0.01），而氟西汀組小鼠體重增長(zhǎng)速度介于正常組和模型組之間。各組小鼠攝食量差異顯著（P＜0.01），模型組小鼠攝食量顯著減少（P＜0.01），而氟西汀和逍遙散組攝食量較

10、模型組顯著增加（P＜0.05）。
　　2.行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果比較：強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型組5 min內(nèi)不動(dòng)時(shí)間顯著增加，氟西汀和逍遙散組5 min內(nèi)不動(dòng)時(shí)間較模型組顯著減少（P＜0.05）。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)提示模型組中央?yún)^(qū)進(jìn)入次數(shù)和停留時(shí)間較正常組顯著減少（P＜0.01）,而氟西汀和逍遙散組中央?yún)^(qū)停留時(shí)間較模型組顯著減少（P＜0.05）,且總運(yùn)動(dòng)距離較模型組顯著增加（P＜0.05）。高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)顯示，模型組開(kāi)放臂停留時(shí)間比例較正常組顯著減少

11、（P＜0.01），逍遙散組開(kāi)放臂停留時(shí)間比例較模型組顯著增加（P＜0.05）。各組小鼠糖水偏好差異顯著（P＜0.01），模型組糖水偏好顯著小于其他三組（P＜0.05）。
　　3.血清D-木糖含量比較：模型組血清 D-木糖較正常組和逍遙散組顯著減少（P＜0.05），而氟西汀組血清D-木糖較模型組無(wú)顯著差異（P＞0.05），較逍遙散組顯著減少（P＜0.05）。
　　4.HE染色顯示：模型組小鼠前額皮質(zhì) PrL區(qū)組織細(xì)胞出現(xiàn)排列紊

12、亂，胞體縮小，胞漿濃縮紅染，核膜核仁分界不清，異染色質(zhì)較多，核皺縮深染等病理表現(xiàn)，而逍遙散組和氟西汀組上述改變明顯減輕。
　　5.ELISA檢測(cè)顯示：模型組BDNF和NGF含量顯著減少（P＜0.05），另外模型組和氟西汀組bFGF含量顯著升高（P＜0.01），且逍遙散和氟西汀組NGF含量較模型組顯著增加（P＜0.05）。
　　6.比色法檢測(cè)顯示：模型組小鼠前額皮質(zhì)谷氨酸濃度顯著增加（P＜0.01），逍遙散和氟西汀組谷氨酸濃度

13、較模型組顯著降低（P＜0.01）。
　　7.免疫組化檢測(cè)顯示：模型組小鼠前額皮質(zhì)GFAP、EAAT1、EAAT2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和OD值均顯著下降（P＜0.01），且NeuN蛋白OD值顯著下降（P＜0.01）；逍遙散組GFAP、EAAT1和EAAT2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和OD值，及NeuN蛋白OD值較模型組均顯著上升（P＜0.05）；氟西汀組EAAT2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和OD值、EAAT1、GFAP、NeuN蛋白OD值較模型組均顯著上升（P＜

14、0.05）。
　　8.Western Blot檢測(cè)顯示：模型組小鼠前額皮質(zhì)中GFAP、NeuN、EAAT1和 EAAT2蛋白的表達(dá)均顯著下降（P＜0.01），逍遙散組 GFAP、EAAT1和NeuN蛋白表達(dá)較模型組顯著上升（P＜0.05），而氟西汀組GFAP、EAAT1、EAAT2和NeuN蛋白表達(dá)較模型組均顯著上升（P＜0.05）。
　　9.qPCR檢測(cè)顯示：模型組小鼠前額皮質(zhì)中的 EAAT2基因表達(dá)顯著下降（P＜0.01

15、），GFAP、EAAT1和 NeuN基因表達(dá)雖存在下降趨勢(shì)，但與正常組比較無(wú)顯著差異，逍遙散組GFAP、EAAT1、EAAT2和NeuN基因表達(dá)較模型組均顯著增加（P＜0.05），氟西汀組NeuN和EAAT2蛋白表達(dá)較正常組和模型組顯著增加（P＜0.05），另外EAAT1和GFAP基因表達(dá)較模型組顯著增加（P＜0.05）。
　　10.尼氏染色顯示：模型組神經(jīng)元數(shù)量顯著減少（P＜0.01），逍遙散組和氟西汀組神經(jīng)元數(shù)量較模型組顯著增

16、加（P＜0.05）；另外，模型組小鼠前額皮質(zhì)神經(jīng)元出現(xiàn)排列紊亂、缺失、損傷明顯、形態(tài)不規(guī)則、核邊界模糊、分布不均勻等病理表現(xiàn)，逍遙散組僅有少量神經(jīng)元形態(tài)不規(guī)則，而氟西汀組較正常組未見(jiàn)明顯異常。
　　研究結(jié)論：
　　1.根據(jù)各組小鼠宏觀表征、各行為學(xué)表現(xiàn)、血清D木糖含量以及“以方測(cè)證”理論綜合判定，本研究采用復(fù)合應(yīng)激方法制作小鼠肝郁脾虛證模型的初步嘗試是成功的。
　　2.根據(jù)肝郁脾虛證模型小鼠前額皮質(zhì)組織形態(tài)的改變、GF

17、AP蛋白和基因表達(dá)減少、以及相關(guān)神經(jīng)生長(zhǎng)因子含量如BDNF、NGF、TGF-β1和 bFGF含量改變等研究結(jié)果，可綜合判定肝郁脾虛證模型小鼠前額皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞功能有一定程度的損傷。
　　3.根據(jù)肝郁脾虛證模型小鼠前額皮質(zhì)EAAT1和和EAAT2蛋白和基因的表達(dá)減少，以及前額皮質(zhì)谷氨酸濃度大幅增加的研究結(jié)果，可判斷肝郁脾虛證小鼠前額皮質(zhì)谷氨酸循環(huán)障礙，此病理改變與其前額皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙密切相關(guān)。
　　4.根據(jù)肝郁脾虛

18、證小鼠前額皮質(zhì)NeuN蛋白和基因表達(dá)減少，神經(jīng)元數(shù)量減少及形態(tài)紊亂等研究結(jié)果可判斷肝郁脾虛證小鼠前額皮質(zhì)神經(jīng)元功能和形態(tài)均受到一定程度的損傷，此病理改變與星形膠質(zhì)細(xì)胞功能減弱導(dǎo)致前額皮質(zhì)谷氨酸濃度大幅度增加有著密切的聯(lián)系。
　　5.逍遙散可通過(guò)改善肝郁脾虛證小鼠前額皮質(zhì)組織病理改變、上調(diào)GFAP蛋白和基因的表達(dá)、調(diào)節(jié)相關(guān)神經(jīng)生長(zhǎng)因子的含量、增加EAAT1和 EAAT2蛋白和基因的表達(dá)、降低前額皮質(zhì)谷氨酸含量、增加 NeuN蛋白和基